高分辨率熔解曲线方法检测不同DNA杂合子

最近，高分辨率熔解曲线法（High-resolution melting）作为一种可以在小的扩增子中来检测单核苷酸多态性基因型的技术被引进。这种基于封闭小管子的方法（包括快循环的PCR）可以在15分钟内完成，并且不需要采用荧光定量PCR仪、等位基因特异性PCR和荧光标记的寡聚核苷酸。该过程通过采用可以检测异源双链DNA的染料得以实现，这种染料在饱和的程度下也不会抑制PCR反应。野生型和纯合子的样品可以通过熔解温度( Tm)的迁移来区别。杂合子样品和纯合子样品可以通过被改变的曲线形状来更好的区分，而不是通过熔解温度。杂合子样品可以产生溶解温度较同源双链更低的异源双链。杂合子产生的被放大的熔解曲线包括2个同源双链和2个异源双链，会产生一个倾斜的复合的熔解曲线。这种熔解曲线在形状上可以很容易与纯合子的曲线加以区别。 然而，在一个扩增子中不同的杂合子是否可以通过不同曲线的形状被区分出来还不太清楚。根据扩增后产生的同源和异源双链的情况，可以将SNPs分为四种类别。不同类别的SNPs异源双链的错配是不同的，因此，如果仪器的分辨率足够有效的话，它们的熔解曲线是可以被区别的。并且，在同种类别中，不同的杂合子也是可以被区别出来。尽管这种错配是相同的，但是最相近的参数稳定性却依赖于相邻碱基的错配，因此，预测出来的稳定性常常是不同的。 我们从ARUP实验室中选取用来做标准临床基因型鉴定的HFE, V Leiden因子和II型多态因子的DNA样品，采用MagNa Pure instrument (Roche)的方法来抽提DNA，采用基于LightCycler的邻近杂交探针[adjacent hybridization probe(HybProbeTM)]的方法来确定基因型。采用探针融合分析基因型的一个优点就是可以用探针鉴定出除了预期改变的序列以为的改变。在ARUP实验室中进行常规的临床分析时，一旦在意外的温度下出现了异常的熔解峰时，样品就会通过进一步的测序来确定序列的改变。在预计的突变附近的一些杂合的序列突变就可以被这样鉴定出来。三个II型杂合子因子（all SNPs），四个V 杂合子 (2 SNPs, 1 个单碱基的缺失和 1 个复合的杂合子)和 6 HFE杂合子 (4 SNPs and 2复合杂合子)可被用来做比较。在选择和完全鉴定样品之后，通过ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.)来确定DNA的浓度。如果可以的话，每个杂合子基因型的3个样品可以被处理。 如需要全文请下载或者登录北京思博全公司网站获取http://www.spectron.com.cn