当我们用动物活体成像系统来检测构建的小鼠肿瘤模型是否成功时,通常会遇到一个问题,那就是用GFP报告基因标记的肿瘤细胞在显微镜下虽然能检测到强发光信号,但是一旦注射进体内后,虽然也能检测到信号,但是背景扣除后就没有有效信号(图1),这是为什么呢?
GFP标记肿瘤细胞成像 | GFP标记肿瘤细胞成像后扣除背景 |
图1
要回答这个问题,我们首先要明白活体成像的成像原理。
小动物活体成像是通过一定的方式对研究对象进行光学标记,使其具有发光的性质,再通过成像技术及设备对光信号进行采集成像。光学标记方式主要采用生物发光与荧光两种技术。
生物发光成像是用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞或DNA,利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的探针光信号;而荧光成像则是采用荧光报告基因(如GFP、RFP)或Cyt及dyes等荧光染料进行标记,利用荧光蛋白或染料产生的荧光就可以形成体内的荧光光源。
那么什么情况下选择生物发光?什么情况下选择荧光成像?本文将为大家作出解答。
生物发光现象在萤火虫(图2)、部分水母等物种中较为常见,这是一种自发光现象,无需外源激发光的照射,经研究发现,这种自发光现象是由于特定的酶促反应引起的,比如荧光素酶和底物荧光素之间的化学反应,导致荧光素被氧化而发光(图3)。
图2 | 图3. 荧光素酶和荧光素的酶促反应 |
根据这一原理,科学家先通过转基因技术把荧光素酶报告基因导入肿瘤细胞,接着把肿瘤细胞注射进动物体内,一段时间以后再注射荧光素,由于荧光素容易扩散进入肿瘤细胞,因此会被氧化发光,从而通过检测光信号就能实现对肿瘤细胞的跟踪。
在一定范围内,发光强度与被标记的细胞数量正相关,通过对发光信号的定量,可以反应肿瘤组织的变化情况。活体成像系统依靠高灵敏度的相机,可以捕捉这种微弱的生物发光信号。因为哺乳动物体内不会有荧光素酶报告基因的存在,因此这种检测方法的优势是特异性好,无背景信号干扰。缺点是应用范围较窄,只能够用于标记细胞。
当荧光物质被特定波长的激发光照射后会吸收能量转变为激发态,激发态并不稳定,会发出另一种波长的光来释放能量,而活体成像系统就是通过捕捉另一种波长的光信号来检测荧光物质的存在(图4),并且光信号的强度在一定的范围内与荧光物质的量成线性关系。
图4 荧光物质受激发后发光的原理
因此荧光信号的采集需要额外的激发光源,并且在相机镜头前还要加装一块发射光滤光片。每个荧光通道的组成都包括激发光源+发射光滤光片。
荧光成像的优点是应用范围广,不仅可以标记细胞,还可以标记药物、纳米载体等。
缺点主要有以下2个方面:
1、某些荧光物质的发射波长较短,容易被吸收,导致穿透性差,体内成像效果差。比如GFP绿色荧光蛋白的发射光中心波长在510nm左右,容易被血红蛋白或其他生物组织吸收,导致成像效果差。
2、许多动物组织(例如毛发、肠道、血管等)受激发光照射后,也会发出500-600nm左右的发射光,这就跟GFP、FITC这类荧光物质的发射光接近,造成成像的背景信号较高,信噪比低,不容易区分有效信号和背景信号。常见生物组织的发射光波长信息请见图5。
图5 常见生物组织的发射光波长
通常的解决办法是选择发射波长较高的荧光物质(发射波长>700nm)进行体内成像,例如DiR、ICG、CY7等。不同发射波长的信号采集效果差异请见图6。
图6 不同发射波长信号采集的差异
案例回顾
让我们回到本文开头的案例,当我们改用荧光素酶来标记肿瘤细胞后,就能很轻松的采集到发光信号,几乎没有背景信号,清晰可见肿瘤细胞的发光部位(图7),可见选对发光体系的重要性。
GFP标记肿瘤细胞成像 | GFP标记肿瘤细胞成像后扣除背景 | 荧光素酶标记肿瘤细胞成像 |
图7
当我们构建小鼠发光模型时,优先选择构建生物发光模型。如果标记物不是细胞,优先选择发射波长较高的荧光物质(发射波长>700nm)进行模型构建,比如ICG、CY7等,也可以得到理想的结果(图8)。
图8 ICG体内成像(右为对照)
总之,生物发光和荧光技术,如何互为补充,取长补短,分别满足不同的研究领域,将来的发展方向是两种技术并重。对于不同的研究,可根据两者的特点以及实验要求,选择合适的方法(参考下表)。
下期预告
还在为了做不好生物发光实验而苦恼吗?下期Clinx勤翔将为大家带来“生物发光实验技巧”,解答更多关于活体光学成像技术的问题,敬请关注!
同时,Clinx勤翔为大家搭建了活体成像技术学习交流群,我们的资深应用支持经理会在群内为大家答疑解惑,欢迎对此感兴趣的老师和同学们扫码加入,共同学习探讨。
相关阅读:
☞ Biology Direct|SFMBT2 的乙酰化和泛素化调节在透明细胞肾细胞癌中发挥肿瘤抑制因子作用
☞ International Journal of Nanomedicine|新型颗粒在治疗类风湿性关节炎的潜在应用
☞ 文献速递--评估α-Gal A mRNA治疗Fabry病的代谢基础
近期活动:
活动邀请|Clinx勤翔与您相约第十七届中国实验动物科学技术年会
动物活体成像 - 荧光成像实验技巧
动物活体成像 - 生物发光活体成像实验技巧
文献合集丨二季度Clinx勤翔精选应用文献集锦
相关产品
XINPOWER电泳仪电源
XINBLOT迷你转印槽
XINDNA 多用途水平电泳槽
XINPRO 迷你垂直电泳槽
勤翔一体式化学发光成像系统ChemiScopeS6
勤翔一体式凝胶成像系统GenoSensS2
紫外透射台
蓝光透射仪
勤翔植物活体成像系统IVScope7000
勤翔凝胶成像系统GenoSens2000系列
勤翔小动物活体成像系统IVScope8000系列
勤翔化学发光及荧光成像系统ChemiSciope6000系列
勤翔小动物一体式气体麻醉RAM1000
勤翔一体式超高灵敏度化学发光成像仪ChemiScope S7
勤翔X光多模式小动物活体成像系统IVScope 8000X系列
关注
拨打电话
留言咨询