突破离子通道与离子转运蛋白研究瓶颈的靶药研发方法

加拿大欧罗拉生物科技有限公司

2017/12/14 16:34

　　最近，加拿大欧罗拉生物公司（Aurora）联同罗氏制药巴塞尔研发团队在 ASSAY and Drug Development Technologies杂志上发表了一篇运用非放射性Flux Assay的方法高通量筛选研究NKCC1靶点调节剂的文章。离子转运蛋白是重要的药物靶点，以离子转运蛋白作为药物研发的靶点具有广阔的前景。文中把离子转运蛋白作为药物靶点，采用的方法突破了以往使用膜片钳技术所不能研究的离子转运蛋白领域，并且该方法是非荧光标记的符合现今提倡的“Lable-free”原则。

NKCC研究意义：

　　NKCC是钠、钾浓度梯度共同驱动的Na+-K+-Cl-内向共转运体（Na⁺-K⁺-Cl^- cotransporter）, 与钾浓度梯度驱动的K⁺-Cl^-外向共转运体KCC同属于氯偶联的共转运体（Cation-Cl^- cotransporter, CCC）家族，在经上皮离子吸收和分泌过程中调节、维持细胞内离子平衡以及细胞体积发挥重要作用。市面上针对NKCC靶点的药物开发主要集中在心脑血管疾病治疗领域，例如高血压、水肿以及心力衰竭等。

　　此外，KCC2/NKCC1是GABA（γ-氨基丁酸）向兴奋性效应转变的关键分子。在神经元内，KCC2调控Cl-从细胞内向细胞外转运（外流），起到降低神经元细胞内[Cl-]i的作用，而NKCC1则促进Cl-从细胞外进入到细胞内（内流），起到增高[Cl-]i的作用，控制着胞内氯离子浓度。GABA向兴奋性转化参与病理性痛的研究机制尚属较新的领域，研究报道较少，对于NKCC1功能性研究，有助于阐明氯共转运体以及GABA在神经病理性痛中神经机制，并为临床新的镇痛药物开发提供新的线索。

　　目前，针对离子转运蛋白的靶点药物筛选工具主要有全自动膜片钳、放射性或非放射性Flux Assay以及荧光染料法等。由于NKCC1属于电中性转运蛋白，其活性开启需要重排蛋白结构，最后暴露或组成酶活性结构，过程比一般的离子通过通道蛋白进出慢很多，即离子进出极慢，可测电流极其微量，因此无法使用膜片钳进行筛选。

　　文中罗氏制药巴塞尔研发团队以NKCC1为靶点，进行靶向药物筛选。其采用了Aurora的离子通道阅读器（ICR）精准检测示踪离子浓度，达到相关活性功能分析，该方法是依靠追踪示踪离子在目标离子通道/转运蛋白进出的情况。

　　使用ICR仪器的两个型号ICR8000和ICR12000分别对一组典型的抑制剂进行盲筛，结果如图（试验化合物的半数抑制浓度( IC50 )），得到的结果与典型的结果基本吻合，误差很少，从而证明了使用ICR的质量可靠。

试验化合物的半数抑制浓度( IC50 ).jpg

　　研究团队为了证明采用ICR测量的数据稳定性，分别采用三部独立的ICR仪器对化合物库中1450种盲样进行非放射性Flux Assay筛选，结果如图（非放射性Flux Assay盲样筛选结果），数据显示 Z'因子＞0.7，说明了ICR检测数据可靠，可以进入下一步的高通量筛选，目标是120万种化合物。

非放射性Flux Assay盲样筛选结果.jpg

非放射性Flux Assay盲样筛选结果

（从总化合物库中随机挑选出1450种化合物，用ICR进行三轮筛选，将三次筛选的结果在三维空间建模，可以发现其中0.7%化合物（红色点）对靶点有明显活性影响，为下一步得到先导化合物提供研究方向。）

结论：

　　Aurora的非放射性Flux Assay以及ICR仪器，能很好的为离子通道/转运蛋白的靶药开发，提供一个高质量、高通量的筛选研究平台，尤其是针对某些电中性的目标。而且实验验证，该方法的数据与其他检测研究方法数据吻合，很好地反映化合物对目标通道/转运蛋白作用的效果。

　　在文章中，也对放射性Flux Assay、Tl⁺敏感的荧光染料指示剂以及Aurora非放射性Flux Assay三种离子通道研究方法进行了总结，发现从细胞毒性、结果准确性以及操作安全性上，Aurora的非放射性Flux Assay更胜一筹。

　　快来看一眼ICR离子通道阅读器的真容吧！

ICR仪器.png

ICR 8000 ICR 12000

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