供货周期: | 现货 |
品牌: | IBA |
规格: | 0.2 -10 ml柱 |
货号: | 2-1202-550 |
CAS号: |
Strep-Tactin® Sepharose®
Strep-Tactin Sepharose提供高结合容量和最低的非特异结合(见下图),可用于重力流纯化。由于Strep-Tactin树脂经过优化适于柱亲和层析,而不适于批量纯化,因此推荐使用预装的Strep-Tactin Sepharose柱。该纯化柱有多种形式,从0.2 ml迷你柱到10 ml柱。
Strep-Tactin Sepharose树脂技术指标:
Strep-Tactin浓度: 5 mg/ml 沉积树脂
结合容量: 1 ml沉积树脂可一步法纯化50-100 nmol 重组蛋白(多达3 mg 30 KDa蛋白质)
支持介质: Sepharose 4FF, 4 % agarose
珠子大小 45 - 165 µm
线性流动速率: 重力流
排阻极限: 3 x 107 Da
形式: 50 % 悬浮在100 mM Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl
稳定性: 室温运输后能保存至少6个月
保存: 4 °C,不能冻存
运输: 室温
Strep-tag® / Strep-Tactin®蛋白质表达与纯化系统
作为后基因组时代表达克隆和蛋白质纯化技术最重要的供应商之一,德国IBA公司开发了一个称为Strep-tag的通用技术平台。这种快速、合算、多样性地生产和使用重组蛋白的技术平台是IBA与TU Munich的Arne Skerra博士教授密切合作开发而成。除了围绕Strep-tag的大型产品组合外,IBA还独家提供应用该技术的蛋白质生产定制服务。
Strep-tag技术开发的原理是众所周知的生物素(biotin)和抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)之间的结合反应。为了将这种牢固的相互作用用于蛋白质纯化用途,研究者们发现需要一个肽,该肽与重组蛋白质融合后,能够结合在streptavidin的生物素结合口袋,从而作为纯化tag。最后研究者们成功设计出一个只由8个氨基酸(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)构成的短序列并称之为Strep-tag II。为了优化结合属性,streptavidin也被设计成为Strep-Tactin。如此,一对优化的结合伙伴被发现了:Strep-tag / Strep-Tactin系统现已成为最被广泛应用的亲和层析系统之一。
Strep-Tactin与多种不同的基质偶联,使Strep-tag融合蛋白得以在生理条件下亲和纯化。与其他tag相比,这些温和的纯化参数能保存蛋白质的生物活性,并仅经一步层析后即可产出超过99%的纯度。
Strep-tag®系统可用于从任何表达系统包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌中纯化Strep-tag II蛋白。用于细菌、哺乳动物细胞和酵母的表达载体请参见本栏目相关章节。
除了表达载体,IBA还提供围绕Strep-tag用于蛋白质纯化、检测、分析(蛋白质固定)、蛋白质:蛋白质相互作用研究以及高通量纯化的完整的产品组合。
The tag 技术 蛋白质
仅8个氨基酸
平衡的氨基酸组成 – 对蛋白质的结构和活性一般没有影响
高选择性和易于控制的结合属性
C-或N-末端融合
无需去除 有效和通用的表达载体,标准化的克隆策略
生理条件下的亲和层析
通过颜色改变可见柱再生和活性状态(见下)
可获得超过99%的纯度 Strep-tag适用于:
金属蛋白
膜蛋白
具有多个亚单位的敏感蛋白质复合体
以及其他任何蛋白质
结合:
GFP Strep-tag 蛋白结合于Strep-Tactin 洗脱:
用脱硫生物素 再生(颜色控制):
开始去除脱硫生物素 再生:
脱硫生物素被完全除去 再生:
用平衡缓冲液快速再生
纯化在E. coli 中过度表达的GFP-Strep-tag II 融合蛋白
图片(从左至右):
1、GFP-Strep-tag II融合蛋白特异结合在Strep-Tactin SepharoseÒ柱上,而非特异性蛋白质被少量生理性洗涤缓冲液迅速洗去。
2、由于加入特异性竞争剂脱硫生物素,Strep-tag蛋白被洗脱。3-5、柱再生:脱硫生物素被黄色溶液HABA取代,后者一旦与Strep-Tactin复合即变为红色。HABA随后被洗涤缓冲液除去,柱子可被重新使用。
怎样获得优良无比的纯化因素
Strep-tag® 纯化系统是基于Strep-tag II肽和特殊设计的Strep-Tactin(streptavidin的变体)之间高选择性和极易控制的相互作用而建立起来的蛋白纯化系统。Strep-tag II对Strep-Tactin的结合亲和力比对streptavidin高将近100倍。在亲和纯化过程中,附了tag的蛋白质结合在被固定了的Strep-Tactin上。生理缓冲液如PBS可与一系列添加剂一起用于该纯化过程。短暂的洗涤步骤之后,在同一缓冲液中加入脱硫生物素(2.5 mM)即可将纯化的重组蛋白温和地洗脱下来。脱硫生物素是一种便宜的、可逆结合的、稳定的生物素类似物,而生物素是streptavidin的天然配体。这种竞争性洗脱是赋予特异性的第二步,从而得到优良无比的纯化因素。该系统安全、易于使用;纯化柱再生和活性状态可以通过纯化柱上的颜色改变来观察到。
Strep-tag融合蛋白可以经Western blots, ELISA, 电子或荧光显微镜进行方便的检测。有相应的Strep-Tactin酶共轭物和抗Strep-tag II的单克隆抗体供出售。
Strep-tag®II对蛋白质的影响可以忽略
此8个氨基酸的短肽tag由于具有化学平衡的氨基酸组成(WSHPQFEK),因此对重组蛋白的影响可以忽略不计。该tag可以被置于C-端或N-端。建议在蛋白和tag之间加入2个氨基酸的间隔以确保tag的可接近性。总的来说,该tag不干扰蛋白质的折叠或生物活性、不与重金属离子缓冲液杂质反应、无离子交换属性、不会诱导蛋白质聚集。因此无需去除该tag。
Strep-Tactin®:长效的亲和柱
Strep-Tactin是streptavidin的一种衍生物,是已知最稳定的蛋白质之一。Streptavidin对以8 M urea或guanidine, 0.5 M NaOH以及50 % formamide (t = 1 h; T = 37 °C)的处理保持稳定。蛋白酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和弹性蛋白酶等) 在1:50 w/w比例下,37 °C孵育2小时都无法切割 streptavidin。当SDS存在时,仅在温度高于60 °C时,streptavidin才开始降解成单体。经过测试,Strep-Tactin已经被证实具有上述作为长效亲和柱必备的卓越特性,可被重复使用3-5次。而且,Strep-Tactin的中性PI值使非特异性蛋白质或核酸的结合降到最低。
Strep-Tactin树脂技术指标
有5种版本Strep-Tactin树脂,区别在于其特性和应用。Strep-Tactin Sepharose®优先用于重力流层析;Strep-Tactin Superflow®和Strep-Tactin MacroPrep® 也可用于低压力或FPLC;Strep-Tactin POROS® (20和50)用于FPLC和HPLC层析。每个基质都会表现出不同的非特异性结合性质,当使用某种基质由于非特异性背景而无法获得满意结果时,建议换用其它的基质(亦请见Strep-Tactin Column Evaluation Sets)。此外Superflow尤其适用于增加的流速,也适用于大的蛋白质复合物的纯化。
请注意,Strep-Tactin树脂被优化用于柱亲和层析,而不适用于批量纯化。批量纯化请使用IBA的MagStrep Strep-Tactin包被的磁珠。
表1: 与Strep-tag/Strep-Tactin相互作用兼容的试剂
试剂 浓度
Reduction Agents
DTT 50 mM
β-mercaptoethanol 50 mM
Non-Ionic Detergents
C8E4 Octyltetraoxyethylene 最高0.88 %
C10E5; Decylpentaoxyethylene 0.12 %
C10 E6 0.03 %
C12 E8 0.005 %
C12E9; Dodecyl nonaoxyethylene (Thesit) 0.023 %
DM; Decyl-β-D-maltoside 0.35 %
LM; N-dodecyl β-D-maltoside 0.007 %
NG; N-nonyl-β-D-glucopyranoside 0.2 %
OG; N-octyl-β-D-glucopyranoside 2.34 %
TX; Triton X-100 2 %
Tween 20 2 %
Ionic Detergents
N-lauryl-sarcosine 2 %
8-HESO;N-octyl-2-hydroxy-ethylsulfoxide 1,32 %
SDS; Sodium-N-dodecyl sulfate 0.1 %
Zwitter-Ionic Detergents
CHAPS 0.1 %
DDAO; N-decyl-N,N-dimethylamine-N-oxide 0.034 %
LDAO; N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide 0.13 %
其它
Ammonium sulfate (NH4)2SO4 2 M
CaCl2 最高1 M
Ethanol 10%
EDTA 50 mM
Guanidine 最高1 M
Glycerol 最高25 %
Imidazole 最高250 mM
MgCl2 1 M
NaCl 5 M
Urea 最高1 M
注意:这些试剂在高达上述浓度下已成功用于纯化如GAPDH-Strep-tagÒ。未标注“最高”的试剂,也许可以使用更高浓度。由于结合依赖于Strep-tag在特殊蛋白质中的空间可及性,所给的浓度值对于其他蛋白质可能有偏差。
提供高结合容量和最低的非特异结合(见下图),可用于重力流纯化。由于Strep-Tactin树脂经过优化适于柱亲和层析,而不适于批量纯化,因此推荐使用预装的Strep-Tactin Sepharose柱。该纯化柱有多种形式,从0.2 ml迷你柱到10 ml柱。
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