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人白介素4 (IL-4)酶联免疫分析 试剂盒说明书 厦门慧嘉生物科技有限公司 本试剂盒仅供研究使用 检测范围:1.6 ng/ml - 100 ng/ml 最低检测限:0.4 ng/ml 特异性:本试剂盒可同时检测天然或重组的人IL-4,且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期:6个月 预期应用:ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中IL-4含量。 说明: 试剂盒保存:-20℃(较长时间不用时);2-8℃(频繁使用时)。 浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。 中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。 实验原理: 用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗IL-4抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗IL-4抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-4呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。 标准品的稀释原则: 2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为100 ng/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml 6.2 ng/ml, 3.2 ng/ml, 1.6 ng/ml.,样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml,临用前15分钟内配制。 如配制50 ng/ml标准品:取0.5ml(不要少于0.5ml)100 ng/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。 生物素标记抗体的稀释原则: 临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则: 临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。 操作步骤: 实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。 为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37℃,60分钟。 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,200μl/每孔,甩干。 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl,37℃,60分钟。 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,200μl/每孔,甩干。 依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。 依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
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