肿瘤特异性抗体功能分析

1、T细胞功能活化及增殖

关于细胞增殖的研究方法主要基于3个方面原理，分别是细胞数目的变化，DNA分裂信号的发生，以及染料渗入亮度的变化。

1、T细胞功能活化及增殖

关于细胞增殖的研究方法主要基于3个方面原理，分别是细胞数目的变化，DNA分裂信号的发生，以及染料渗入亮度的变化。

对于第一种方法，细胞数目的变化可以采用自动细胞计数仪，不但可在十几秒内完成快速计数，自动光强度调节和自动聚焦等功能还可减少不同用户之间、不同样本之间、和不同玻片之间的计数差异减。尤其是Countess 3细胞计数仪利用人工智能和深度学习神经网络算法来实现高准确度的细胞计数，即使对于具有挑战性的细胞样品类型也能准确计数。

另外一种较为常用的就是基于细胞氧化还原能力改变来表征细胞是否有增殖能力（Varioskan LUX、Multiskan SkyHigh酶标仪），这种方法最传统的方法是MTT，但由于方法较繁琐，固体颗粒生成物甲赞也使得方法的准确度和可重复性受到影响，到后来改进的XTT方法由于也是基于类似原理，目前已进一步优化为高灵敏度AlamarBlue和PrestoBlue检测法（Varioskan LUX、Fluoroskan FL、Fluoroskan酶标仪）。

基于新生DNA合成的EdU检测法，主要以核苷类似物形式插入到新生DNA中，并与带荧光的叠氮基发生点击式化学反应，产生的荧光信号可表明细胞是否已发生增殖，这种试剂如果与CD3marker共染T细胞，即可观察和分析其中发生增殖的这部分T细胞。

还有一种也是目前普遍用于分析T细胞增殖传代的分析的方法，及细胞示踪的方法，最为常用的是CFSE以及其他cell trace染料，如果我们对T细胞比如CD4T共染cell trace和CD4marker进行流式分析（Attune NxT流式细胞仪），不仅可以清楚观察到这群细胞增殖情况，而且可以分析各传代过程中CD4亚群细胞所发生的变化。

2、细胞因子分析

另一关于T细胞的功能活化研究就是混合淋巴细胞反应 (Mixed Lymphocyte Reaction; MLR)，这个方法首先需要分选富集CD4+T细胞，并对CD14+DC细胞富集诱导分化培养，加入功能抗体，然后再分别从蛋白水平和基因水平表达来分析细胞培养上清中的细胞因子，那么对于细胞因子的分析，除了传统的ELISA方法，目前也有灵敏度更高的ProQuantum检测，适用于珍惜样品进行高通量检测的Procarta，单细胞水平的Elispot，以及可以同时在RNA水平及蛋白水平同时进行分析的Primeflow，通过流式平台，应用primeflow技术我们还可以同时检测胞内以及分泌蛋白的RNA变化。

3、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC）

这个方法可以从3个分析方法来研究，首先第一个是基于PBMC效应细胞的方法，该方法基于天然NK细胞中的FcRIII与抗体Fc相结合，抗体Fab段与靶细胞（这里通常指肿瘤细胞）结合，建立细胞间连接，最终表现为Target细胞裂解，这个方法结果真实，但由于PBMC提供者差异，导致结果的不可重复性，且实验周期较长，操作繁琐，具体来讲，主要先从PBMC中富集纯化得到NK细胞，再经过刺激活化，同时再将靶细胞进行染色标记后与活化的NK细胞进行一定比例混合，加入功能抗体后进行共培养，对靶细胞的杀伤，通收集过细胞上清进行Cr51或LDH检测，或者直接收集细胞进行进行其凋亡和杀伤的流式检测（Attune NxT流式细胞仪）。

第二类也是目前较为主流的ADCC检测方法，该方法是第一步以表达FcRIII 的带报告基因的工程细胞株作为效应细胞并验证其有效性和稳定性，同时系统中通常需要具备细胞信号通路激活基因:NF-Kb,NFAT等，然后实验中需要加入靶细胞，报告基因工程细胞株以及功能抗体，通过加入Luciferase试剂产生发光信号来进行检测（Fluoroskan FL、Luminoskan或Varioskan LUX酶标仪）；这个方法可重复性高，操作简便，易于放大，但因为对报告基因的检测并非直接反应真实结果，因此常作为筛选手段，而难以成为直接的放行标准。

第三种就是单细胞水平的single cell analysis。这种方法与第一种方法类似，也以PBMC或者NK细胞作为效应细胞，最终通过直接检测靶细胞死亡情况来评价ADCC杀伤。这种方法可以通过高内涵仪器（CellInsight CX7高内涵系统）和流式平台（Attune NxT流式细胞仪）完成单细胞水平的高通量检测，主要用到两种常用试剂即cell trace染色用于示踪以及细胞活死染料。

4、抗体介导的补体依赖的细胞毒性（complement dependent cytotoxicity; CDC）

指的是补体通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，激活补体经典途径，形成的攻膜复合物裂解靶细胞的作用。

特异性补体依赖性杀伤试验：

例如可以用CellTrace紫罗兰染料标记CD20+细胞（ROMA），用CellTrace远红色染料标记CD20-细胞（Jurkat），将细胞1:1混合，用10nm利妥昔单抗和10%人血清孵育1h，再加入SYTOX Green染料，再采用Attune NxT流式细胞仪和酶标仪（Varioskan LUX）分析结果

显示，细胞溶解只发生在功能性利妥昔单抗、活性血清和抗原阳性细胞中。

5、巨噬细胞抗体依赖性的细胞吞噬作用（Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis; ADCP）

基于抗体的免疫疗法已被证实是治疗疾病的一种有效途径。通过将Fc区与免疫细胞表面上的FcγR结合，抗体可使一些效应细胞产生较强的细胞毒性作用，除了ADCC，还有抗体依赖性的细胞吞噬作用（ADCP）。ADCP是一种通过抗体同时结合于靶细胞（如肿瘤细胞）和效应细胞如巨噬细胞从而诱导效应细胞对靶向细胞的吞噬作用， 吞噬后通过酸化作用导致靶细胞在效应细胞内消化和降解。 ADCP被认为是多种生物药物例如抗CD20，CD38，EGFR，HER-2的主要MOA，同时巨噬细胞介导的通过使用抗CD47抗体阻断抗吞噬CD47-SIRPa相互作用的肿瘤细胞吞噬作用已在各种人类恶性肿瘤的临床前异种移植中显示出希望。另外可能由于表面的FcRs减少，巨噬细胞的吞噬作用持续减弱(hypopophagia[即巨噬细胞的吞噬作用低])；巨噬细胞是多种治疗性mAb的关键效应细胞，hypophagia可能会导致患者对mAb耐药。巨噬细胞抗体依赖性的细胞吞噬作用（ADCP）是治疗性单克隆抗体(mAb，如利妥昔单抗）和抗体诱导的溶血性贫血和免疫血小板减少的主要细胞毒性机制。

EVOS™智能细胞分析系统结合Molecular Probes™案例分享：

巨噬细胞ADCP标记实验：利用抗体内吞的染料pHrodo pH敏感性指示染料（该指示剂中性条件下无荧光，酸性条件发出强烈的荧光，且随着pH值的降低而增强，因此对物质的细胞内吞清晰可见）进行标记；用pHrodo试剂进行靶细胞标记，用cell trace标记巨噬细胞，加入抗体后孵育，上图结果显示，同时在巨噬细胞中加入阳性靶细胞和功能抗体的实验组可以看到明显的ADCP效应；而只加阳性靶细胞，不加抗体组则虽然有微弱红色荧光但无ADCP现象；如果两者都不加，则看不到红色信号。

Attune Nxt流式应用案例分享：

利用流式方法对ADCP效应评估：分别对曲妥珠单抗（her2）在SKBR3（人乳腺癌）中，以及利妥昔单抗在人B淋巴瘤细胞中是否发挥ADCP作用进行类比分析，结果显示通过以pHrodo进行指示标记，可以观察并分析到这两种抗体均发挥了ADCP效应。

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