过去3年里, CRISPR——成簇的、规律间隔的短回文重复序列——革新了基因组编辑领域。CRISPR相关蛋白9(Cas9)由向导RNA引导,切割基因组特定位置的DNA,形成DNA双链损伤。本文主要简单介绍Cas9通过与目标基因结合,从而发生切割作用的过程。
为产生DNA双链断裂,Cas9必须对DNA的双链都进行切割。 因此,Cas9包含两个核酸酶结构域——HNH域和RuvC域。Cas9 的crRNA(CRISPR derived RNA)中存在一段与目标DNA互补的序列,以及一段短的前间区序列临近基序(protospacer adjacent motif, PAM),以此来识别目标位点。同时,Cas9靶向基因,还需要一条反式激活crRNA(trans-acting crRNA, tracrRNA)、tracrRNA与crRNA人工融合,形成一条具有引导作用的sgRNA。这种方法常用于基因组编辑试验中。SgRNA与目标DNA链结合后,会形成一个R形的环,crRNA的引导区域会侵入这一区间,与目标链形成碱基互补配对。RNA聚合酶II处也会形成一个类似的R环(图1)。R环形成后,Cas9的HNH域开始切割互补序列,而RuvC域则开始切割非互补序列。这两个酶的同步切割确保了要么同时切割了DNA的双链,要么两条链都不切割。
图1 Cas9和DNA双链的互动激活了Cas9的酶活力。Cas9切割造成的双链断裂是CRISPR介导的基因组编辑的基础。Cas9能稳定R环结构,机制和RNA聚合酶II稳定R环结构的机制类似。
Cas9能够单独与sgRNA结合,或与包含PAM序列的双链DNA结合,表明Cas9可以采取不同的构象状态,但仍然不能解释Cas9产生双链断裂的原因。在每个早期结构,HNH域活性部位和切割位点存在30埃米(3纳米)的距离。此外,RuvC域活性位点与DNA结合也并未在以前的结构中观察到,这是因为缺乏完整非互补链。Jiang等人报道的晶体结构捕获双链DNA,使其处于解旋状态。HNH和RuvC域各自靠近其切割位点。Cas9复合体的构象发生变化,比以往的DNA-包含结构都要紧凑。这一构象改变,驱动结构重排,促进高效协调的双链DNA切割。
双链DNA结合后,最突出的结构重排发生在HNH域,原本HNH域朝向双链DNA结合复合体,旋转180°度后,改为朝向互补链。连接HNH和RuvC域的区域也发生局部结构重排,通过与分离的DNA接触,稳定R环结构,并直接引导互补链入RuvC活性部位。总的来说,HNH域的重定向和连接部位的重排从结构上证实了HNH和RuvC域的变构效应。
为进一步了解Cas9如何与目标双链DNA结合,Jiang等人利用低温电子显微镜(cryo-EM)确定了Cas9-sgRNA域目标双链DNA结合后、分辨率为6埃米的结构,以及Cas9-sgRNA复合体分辨率为4.6埃米的结构。他们发现,Cas9与DNA双链的互动,会使DNA发生30度的螺旋转动,这一转动有助于R环的稳定。这一研究成果不仅阐明了Cas9与DNA结合的机制,也进一步证实了冷冻电镜的发展。虽然已有文献报道更高分辨率的冷冻电镜,冷冻电镜结构分辨率最终取决于样本本身。鉴于Cas9复合物相对小(约220 kDa),以及其构象的可塑性,Jiang等人达到的分辨率已臻至完美。
了解与DNA双链的结合激活DNA切割酶的机制,不仅能促进我们对Cas9切割特异性的理解,还为未来的基因组编辑体系提供了思路。基于Cas9的新DNA切割酶特异性更高,Jiang等人的研究推动了新切割体系的设计,有助于减少脱靶效应——目前基因编辑领域的最大顾虑。这种新的结构信息还为设计基于荧光的实验提供了蓝图。细胞内Cas9与DNA结合时,复合体构象发生变化,荧光分子发出荧光。
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