1、确保使用正确的缓冲液
Annexin V是钙离子依赖性蛋白,主要结合到磷脂酰丝氨酸。这些磷脂一般都是朝向细胞内的,在早期凋亡时,这些磷脂会反转向外。通过Annexin V和透膜的染料(如7-AAD或PI),可区分早期和晚期凋亡。Annexin V的结合依赖于钙离子,所以需要在标记时确保使用含钙离子的缓冲液。
2、Annexin V结合不稳定
与抗体结合不同,Annexin V的结合不稳定,也不容易被固定,所以在标记结束后1-3小时内必须要上机检测。
3、设计正确的实验
确保试剂可诱导凋亡,而不是诱导坏死。sub-G1检测凋亡常常会被错用,尽管在用标准DNA染料检测时,凋亡细胞的DNA峰将会出现在G1峰左侧。然而,如果实验设计不正确,亦将会导致错误的假性结果。
4、查看你的固定液
甲醛固定液可导致DNA小碎片出现,从而会使凋亡假性增多,所以切勿固定。
5、必要时考虑TUNEL
对于贴壁细胞,细胞膜容易在消化时受损,产生Annexin V假阳性,故对于贴壁细胞,可考虑TUNEL法。TdT介导的dUTP末端标记(TUNEL)法使用TdT标记使DNA断裂末端标记上dUTP,从而可被抗BrdU抗体检测到。此时,你就需要使用甲醛固定液。
线粒体膜电位丢失也是凋亡早期发生的标志之一,同时细胞凋亡时还会释放细胞色素C,从而导致caspase活化。这些方法也可以用在贴壁细胞上。
6.小心选择染料
检测线粒体膜电位有三种染料:罗丹明123、DiOC6(3)、JC-1。罗丹明123需要与PI配合使用,可区分活细胞(罗丹明123阳性)、早期凋亡(罗丹明123增高)、晚期凋亡(PI阳性)。JC-1在凋亡发生时,可从绿色荧光转换为橙色荧光。
7、不要过度解读数据
有些论文认为线粒体膜电位可能并非凋亡的关键步骤,所以,检测活化caspase就非常重要。
最后要提一下,各种检测凋亡的方法都有优点和缺点,所以如何去解读它非常重要,了解凋亡的发生机制很关键。
酶标仪科普专栏丨第二期:荧光偏振(FP)介绍及应用
从分子到疾病:线粒体动力学研究取得新突破
【会议预告】第三届 3D 细胞类器官应用与高内涵成像技术研讨会邀您参加
开学啦|新学期,“心”守护实验室仪器免费巡检报名名额领取中
相关产品
上海美谱达UV-3200扫描型紫外/可见分光光度计
Leica徕卡DM750M正置显微镜
希森美康ExoCounter 全自动外泌体分析仪
智能化共聚焦高内涵成像分析系统
比利时 Bioruptor plus非接触式全自动超声破碎仪
DM3000德国徕卡leica生物显微镜
徕卡生物倒置显微镜LeicaDMi1
希森美康ExoCounter 全自动外泌体分析仪
梅特勒托利多pH 复合电极 LE438
Diagenode全自动核酸剪切仪Megaruptor ®3
化学发光成像仪Amersham ImageQuant 800
BIORUPTOR超声波细胞破碎仪new pico比利时Diagenode
美国博勒飞AMETEK Brookfield CTX质构仪
美国思拓凡 cytiva go蛋白纯化系统
ATS超高压均质机AH-D400
关注
拨打电话
留言咨询