我们是谁？双荧光素酶报告基因系统！！！

北京德泉兴业商贸有限公司

2017/08/21 10:24

双荧光素酶报告基因系统简介

双报告基因同时用于同一实验系统进行检测，通常一个报告基因作为内参，另一个报告基因用来指征系统指标变化。其中，作为内参的基因与组成型启动子偶联，其表达不受实验条件改变的影响；指征系统变化的基因与调控启动子偶联，其表达与调控启动子转录活力相关。通过这种方法，可减少细胞数目、细胞活力以及细胞转染和裂解效率等内在变化因素所削弱的实验准确性。

近几年来，氯霉素乙酰转移酶（CAT），β-半乳糖苷酶（β-Gal），或葡萄醛酸糖苷酶（GUS）作为内参基因，与萤火虫荧光素酶报告基因相互搭配进行双报告基因检测。但是，这些内参基因削弱了荧光素酶快速、灵敏、线性应答范围较宽的优势，正逐渐被海肾荧光素酶取代。

如同萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶的活性也不需要翻译后修饰，一旦翻译完成即可行使报告基因功能。双荧光素酶报告基因检测过程中，萤火虫和海肾荧光素酶活性是在同一裂解液中分步检测的，在完成萤火虫荧光素酶活性（实验报告基因）检测后，萤火虫荧光被快速淬灭，并同时激活海肾荧光素酶活性（对照报告基因）。通过综合两种基本化学检测，对转染细胞裂解液或无细胞转录/翻译系统中的两种荧光素酶报告基因进行快速而准确的定量，可以真实灵敏的反映所需研究生物过程在特定药物、蛋白或病毒影响下的变化。

双荧光素酶报告基因检测注意事项

1、报告基因检测受多种因素影响（载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔。

2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解

3．双荧光素酶报告基因的载体选择：

a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；

b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子（如SV40、CMV），而选用中等强度的启动子（如TK）

4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

5．最适反应温度：室温（20-22℃）。各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。

6．双荧光素酶反应体积：20ul（细胞裂解产物）-100ul（萤火虫荧光素酶底物）-100ul（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差。

7．细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年。

8．裂解产物与底物混合（手动加样）：要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。

9．发光半衰期：

a)单荧光素酶检测，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12min

b)双荧光素酶检测，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min

10．检测结果

样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。

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