现有的CAR-T都是利用病毒等载体将编码CAR的基因序列随机整合到T细胞基因组内,这种随机的基因整合有引起细胞癌变的风险,此次整理、分享的内容是利用CRISPR Cas9系统将靶向CD19的CAR基因片段“定点”整合到TRAC(T-cell receptor α constant)位点,将CAR的表达置于TRAC的调控之下,这种“定点”整合不但不影响CAR的表达,而且还能够增强CAR-T的“威力”!
文章大概思路整理如下:
CAR的整合位点(TRAC第一个外显子5’末端)及实验流程
CRISPR Cas9能有效的将TCR knock out,同时将CAR knock in - 蛋白水平
CRISPR Cas9能有效的将TCR knock out,同时将CAR knock in - 核酸水平
相较于病毒载体组(RV-1928z)的随机整合,基于CRISPR Cas9的定点整合组(TRAC-1928z)CAR的表达变异系数更小、更均一
In vitro实验中随机整合和定点整合CAR-T裂解肿瘤细胞的能力及自身增殖能力并无差异
In vivo实验中TRAC-1928z定点整合组活性更好
对骨髓CAR-T、肿瘤细胞检测:RAC-1928z定点整合组(蓝色)CAR-T细胞数目不会减少,同时能使骨髓肿瘤细胞数目较少
对各组CAR-T细胞亚型进行分析:随机整合组(红色、绿色)亚型呈现终末分化(terminal differentiation)和疲劳亚型(exhaustion)
对各组CAR表达水平进行分析:定点整合组(TRAC-1928z)CAR-T在infusion之后CAR的表达水平不会下调,表达稳定,而随机整合组(RV-1928z-TCR-和RV-1928z)在infusion之后CAR的表达下调,且下调不是转录层面变化引起的
让T细胞表达CAR之后(Transduction5天后)在无抗原刺激、静息条件下看CAR-T的自发分化及信号激活:随机整合组表现出自发的T细胞分化和信号激活
抗原刺激后看细胞分化水平(细胞亚型、转录因子),随机整合组过快的进入了终末分化(terminal differentiation)
上面验证了将CAR基因序列定点整合到TRAC调控之下所带来的优势-These results indicated that the improved efficacy of TRAC-CAR T cells is related to its CAR expression level by reducing tonic signalling and delaying T-cell differentiation upon stimulation. 那整合到其他位点会是怎样的效果?文章作者又额外做了B2M和几个启动子对CAR-T功能的影响,如下:
将CAR定点整合到不同位点以及在不同启动子调控之下CAR的表达水平
比较在无抗原刺激、静息条件下看CAR-T的自发分化:CAR的表达水平越高,自发分化越明显
选取有代表性的4组,比较在抗原刺激下CAR-T的分化:TRAC-1928z组和B2M-1928z组表现为central memory表型
评估不同CAR-T体内效果:只有TRAC-1928z组表现出抑瘤作用、提高存活率的疗效
比较各组在抗原刺激下CAR表达的调控模式:CAR的下调是基于受体的internalization之后的降解,而下调之后的上调需要转录层面的“支持”(提供新的mRNA)
Eyquem J, Mansilla-Soto J, Giavridis T, et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection[J]. Nature, 2017, 543(7643):113.
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