生命行为本质上是基于结构的互作所引起的!分子间相互作用的检测方法有很多,如IP、SPR、ITC、FRET等,细胞间相互作用的研究目前科学家们只能依赖活细胞工作站,像“狗仔队”一样蹲守、抓怕,存在“断章取义”风险!此次整理分享的是利用流式细胞术检测抗原提呈细胞DC与T细胞的相互作用,流式较显微镜有着无可匹敌的优势 - 显微镜只能通过拍到两个细胞相互接触那一刹那来证明互作(而且视野里就那么几个细胞,无法说清是个别行为还是普遍行为),而这次分享的流式方法只要两者有过接触都能够检测出来,所得数据更加全面、更具说服力!
首先是方法:
所用工具是SrtA和G5:SrtA可以识别结合LPETG肽段,结合后可将这个肽段共价转移到G5上
工具用法:一个细胞表达SrtA,另一个细胞表达G5,两者如果能够互作,SrtA细胞识别结合带标记的LPETG底物就能够转移到G5细胞上
研究者将HEK293T细胞分为4组,表达以上蛋白:G5-CD40、CD40L-SrtA为检测互作的实验组,CD40L*-SrtA、Srt-PDGFR组为阴性对照组(CD40L*和SrtA不会与CD40互作)
只有G5-CD40细胞生物素表达升高,说明只有它与CD40L-SrtA细胞发生了互作,初步说明此种检测细胞互作方法的有效性和特异性
WB结果也证明了方法的有效性和特异性
用更多的互作组合证明方法有效性和特异性
换一种细胞组合,用显微镜的方法证明方法的有效性和特异性
Ex vivo验证:
构建转基因小鼠,G5-DC细胞(提呈OVA),SrtA-T细胞(OVA特异性),实验流程图
OVA刺激可引起DC与T的互作,CD40L抗体能够阻断DC与T的互作,DC无法再接受T细胞SrtA转移来的生物素标记底物,但不会影响T细胞表达的SrtA识别结合生物素标记
抗原刺激引起DC细胞与T细胞互作的“量效”曲线
前面用DC做APC,拿B细胞做APC验证,同时看T细胞的激活
TCR是OVA抗原特异的,只与提呈OVA的APC互作:只有提呈OVA的DC可与T相互作用,“得到”生物素
抗原刺激引起DC细胞与T细胞互作的“时效”曲线
In vivo验证:
DC可与T细胞发生互作,接受T细胞传递的生物素,同时激活T细胞
所用细胞不会与生物素标记的底物非特异性的结合
细胞互作的检测基于对生物素的检测,看标记物(生物素)的“代谢”
DC与T作用不同时间后检测两者的互作情况
看与不同DC亚型的互作:稀有的的XCR1亚型DC与T的互作亦能检测到
有文献报道,DC上的CD40可不依赖抗原的与T上是CD40L互作,所以检测这种情况对于特异性的影响:
所用T细胞的TCR是OVA特异性的,当DC与T“在一起”48h后,除了可与提呈OVA的DC互作外还与提呈LCMV-GP的DC发生了互作,“在一起”12h能保持互作的特异性
相较活细胞工作站检测互作的方法,流式的优势体现在快速、有统计学意义-瞬间完成大群细胞的检测,而显微镜需要长时间拍摄同时需要足够的耐心去找寻相关片段,找到片段里又只有“几个”细胞!
各种技术手段都是工具,使用者的根本目的其实不在工具、方法的掌握,而在得到高质量的数据,我们的价值就在于让您将工具用的更好,把注意力放在更有价值的事情上!
Giulia Pasqual, Aleksey Chudnovskiy, Jeroen M. J. Tas, Marianna Agudelo, et al. Monitoring T cell–dendritic cell interactions in vivo by intercellular enzymatic labelling.[J]. Nature, 17 January 2018.
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