针对实体瘤,CART细胞traffic到肿瘤部位并在此停留、存活一直是个需要解决的问题,之前整理分享过一篇Nature,文章作者发现了一个转录因子此能够促进T细胞的停留,这次分享的文章是通过引入IL-7和CCL19提高CART细胞的增殖及浸润能力。
CAR的设计:CAR(三代、靶向CD20),IL-7(提高细胞的增殖、生存能力),CCL19(提高细胞的迁移能力)
CAR的表达情况
在CART中引入了IL-7和CCL19,进行验证:7x19 CART能特异性的响应刺激分泌IL-7和CCL19 ( red bar: co-cultured with mitomycin C-treated P815-hCD20, gray bar: immobilized anti-CD3 mAb, blue bar: negative controls, CAR-T cells were co-cultured with mitomycin C-treated P815, white bar: negative controls, without any stimulations)
In vitro:抗原刺激后7x19 CART有更强的增殖能力
不刺激不增殖,多轮刺激7x19 CART依然增殖,表现出更强的persistence
In vitro:抗原刺激后7x19 CART有更强的迁移能力
In vitro:特异性杀伤肿瘤细胞的能力
In vitro反向验证IL-7的作用:CD127为IL-7受体,CCR7为CCL19受体,利用抗体分别阻断两个受体,阻断IL-7受体7x19 CART的增殖收到抑制,阻断CCL19受体不影响增殖
In vitro反向验证CCL19的作用:阻断CCL19受体抑制了7x19 CART的迁移
In vivo:延长荷瘤小鼠生存时间
In vivo:抑制肿瘤生长(还做其他类型肿瘤,套路都一样,思路最重要,故略去)
文中主做的是双共刺激域的三代CART,关于二代或者三代CART谁好一直没有定论,所以验证了一下二代CART:7x19二代CART依然表现出了优于传统CART的抗肿瘤作用,暗示引入IL7、CCL19的意义
In vivo正向验证了引入IL7和CCL19的意义之后开始反向验证:设计了分别引入IL-7和CCL19的CART
单一引入一种因子或者将两种CART物理混合的效果均不如将两种因子同时引入的7x19 CART好
高分文章牛的地方就在于“像强迫症一样的折腾”,“阻断”IL-7和CCL19后看7x19 CART的效果:延长存活。抑制肿瘤生长的作用被削弱,反向证明了IL-7和CCL19的积极作用
对于实体瘤,病理切片不可少,HE片子:7x19 CART治疗组肿瘤出现了更多的坏死区
7x19 CART治疗组有更多的T细胞浸润到了肿瘤部位-呼应CCL19
7x19 CART治疗组还出现了DC细胞浸润,且与T细胞共定位,暗示7x19 CART能把DC细胞召集到肿瘤部位(DC细胞有抗原提呈作用,它应该会把内源T细胞“
激活”,所以,往下看!)
构建了一个能够抗受体鼠内源T细胞的模型:7x19 CART是用CD90.1-CD90.2+的细胞制备的,受体鼠自身T细胞为CD90.1+CD90.2-,发现受体鼠内源T细胞(CD90.1+)的确出现在了肿瘤部位
用抗体“消灭”受体鼠内源T细胞后,7x19 CART抑瘤作用减弱,暗示除7x19 CART抑瘤外,内源T细胞也有贡献
CART细胞治疗后存活4周的小鼠脾脏T细胞亚型进行分析:7x19 CART治疗组,不管是内源T细胞还是CART细胞都有更高比例的central memory亚型(CD44+CD62L+)
分选得到CART细胞和内源T细胞:7x19 CART细胞依然能够特异的对抗原刺激产生反应分泌IFN-γ;传统CART治疗组的内源性T细胞对于新肿瘤抗原刺激不会产生反应,而7x19 CART治疗组的内源性T细胞会对新抗原产生反应,暗示7x19 CART诱导受体鼠产生了肿瘤反应性T细胞
为了验证“7x19 CART诱导受体鼠产生了肿瘤反应性T细胞”的猜想,对7x19 CART治疗组存活下来的小鼠进行再次种瘤,发现无再次接种的肿瘤是否表达CD20抗原,7x19 CART治疗过的小鼠均能看自身抑制肿瘤生长,再次证明7x19 CART7x19 CART诱导受体鼠产生了肿瘤反应性T细胞,且能识别结合新的肿瘤抗原-表位扩展
这篇文章前面的部分就是通常做CART的套路:设计、检测增殖、杀伤、分化、浸润等,笔者觉得最有趣也是最具提示意义的地方在于CART和DC共定位、内源T细胞浸润到肿瘤部位并产生了肿瘤反应性,这里面还有深层次的免疫细胞间“互作”可挖。CART只是对大自然亿万年进化而来的T细胞进行了小小改造,我们“功利”性的关注它和肿瘤细胞的“互作”,但是“一石激起千层浪”也说不准 - 进入体内后其实CART会“偶遇”很多很多......
Keishi Adachi, Yosuke Kano, Tomohiko Nagai, Namiko Okuyama, et al. IL-7 and CCL19 expression in CAR-T cells improves immune cell infiltration and CAR-T cell survival in the tumor.[J].Nature Biotechnology, 30 January 2018.
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