长非编码RNA主要起维持细胞核完整、调控基因表达的作用,此次整理分享的文章研究的是长非编码RNA在核糖体RNA合成过程中如何发挥其调控作用。这篇文章做的极其“细腻”,具体内容如下:
RNA测序发现长非编码RNA SLERT高表达,NB也确认了这一点
SLERT表达模式
以SLERT表达水平相对低的HeLa细胞为工具,设计缺失不同位点的质粒转染,NB检测SLERT表达水平,发现位于末端的H/ACA snoRNP对于SLERT表达是必须的
SLERT定位于核仁,而编码SLERT的TBRG4 DNA不定位于核仁,暗示SLERT表达后会重定位
对SLERT进行突变,发现位于末端的snoRNA被突变后SLERT不再定位核仁,而具备snoRNA末端、中间序列插入EGFP组依然定位于核仁,暗示SLERT需要snoRNA末端以重定位到核仁
因为SLERT定位于核仁,而核仁是rRNA的合成场所,所以设计用CRISPR Cas9 KO掉SLERT:只KO了SLERT,而未影响TBRG4蛋白的表达
KO SLERT后pre-rRNA及成熟rRNA均下调,暗示SLERT参与rRNA的合成调控
F:5-FU阻断pro-rRNA processing发现KO SLERT后未成熟pre-rRNA合成降低,暗示SLERT是在转录层面调节rRNA的合成;G:荧光素酶报告基因法确证了SLERT是在转录层面进行调节
KO之后rescue再次确证SLERT调控pre-rRNA合成
在功能上的调控必定依赖于结构层面的互作,因此给SLERT加一个tRSA标签,去“钓”与SLETRT互作的蛋白(RBPs)
钓完之后质谱分析,发现了蛋白DDX21
反过来蛋白DDX21也钓到了SLERT,共定位结果也确证了两者发生互作
完整的SLERT和非snoRNA段钓DDX21的能力相当,暗示SLRERT上互作位点在非snoRNA段
看SLERT上哪一段与DDX21互作-281-423的143nt长片段
EMSA实验再次确证SLERT143为与DDX21互作序列
由SLERT以互作为线索找到了DDX21,看DDX21的定位情况:定位于核仁
SIM拍到了DDX21在核仁内更加细节的情况:DDX21呈圆环样分布于核仁,平均每个细胞有约60个圆环状结构(为了排除是抗体或者固定造成的环状结构,作者还做了活细胞成像,确证DDX21呈环状分布)
分别用AMD阻断rRNA转录或5-FU阻断rRNA processing发现阻断转录后DDX21不再形成环状结构,阻断rRNA processing不影响其环状结构形成,说明DDX21的组装发生在rRNA转录阶段
DDX21组装成环状结构在转录阶段形成让人联想到在转录阶段很重要的RNA聚合酶,SIM观察两种共定位后发现RNA聚合酶亚单位RPA194定位于DDX21环的中心位置
多种细胞系的活细胞成像结果确证了RNA聚合酶定位于DDX21环状结构中心
IP结果确证了DDX21与RNA聚合酶发生互作
结构层面的互作往往意味着功能层面存关联,沉默DDX21后发现pre-rRNA及未成熟pre-rRNA上调,暗示DDX21抑制rRNA的合成
沉默DDX21后,编码rRNA的rDNA占位增加,暗示DDX21是通过阻止RNA聚合酶占位DNA抑制rRNA的转录最终抑制rRNA的合成
前面观察到DDX21环状结构中心是RNA聚合酶,而RNA聚合酶可以结合rDNA,这些再结合支撑文档一些数据(略)提示做三者的共定位研究,发现:RNA聚合酶包裹rDNA,DDX21包裹RNA聚合酶这种“大圈套小圈”的模式
前面已经证实DDX21能影响pre-rRNA的合成,那两者的定位关系呢:pre-rRNA定位与DDX21环状结构边缘,pre-rRNA的量与DDX21环的直径正相关
前面还发现了SLERT能影响pre-rRNA的合成,共定位研究发现SLERT与DDX21共定位,不与RNA聚合酶共定位
SLERT不但与DDX21共定位,而且其表达量与DDX21环的直径正相关
KO SLERT并不影响RNA聚合酶及DDX21的表达,但这三者都能影响pre-rRNA的合成,且存在一定关联(互作/共定位),SLERT影响DDX21环的直径,文章作者创造性的假设SLERT通过影响DDX21构象调节pre-rRNA的合成
荧光共振能量转移实验研究SLERT对于DDX21分子内及分子间互作的影响,发现KO SLERT之后DDX21分子内头尾互作降低,分子呈open构象;分子间互作不收SLERT调节
IP找DDX21上与SLERT及RNA聚合酶互作的序列(两端序列负责定位,支撑文档里有相应数据支持,略去)
KO SLERT后DDX21与RNA聚合酶互作增强,暗示Open构象的DDX21(这个说法依据为FRET结果)与RNA聚合酶互作能力强
IP实验确证:SLERT竞争性抑制DDX21与RNA聚合酶互作
过表达SLERT促进RNA聚合酶对rDNA的占位,KO则抑制,结合前面的结果:SLERT通过竞争性抑制DDX21与RNA聚合酶的互作促进RNA聚合酶占位rDNA,启动转录
综合起来:SLERT与DDX21互作,促进其分子内头尾互作,影响DDX21构象使其组装成更大的减少与RNA聚合酶Pol I的互作,促进pre-rRNA的合成。当SLERT缺乏时,DDX21成open构象,组装成的环直径变小,与RNA聚合酶Pol I互作,抑制pre-rRNA的合成
失调的rRNA合成与肿瘤发生有关,KO SLERT后细胞增殖及肿瘤生长受到抑制,过表达则促进细胞增殖,,暗示SLERT能促进肿瘤发生 - 做两个小实验“拉近”一下和应用转化的关系-a potential therapeutic target
文章按逻辑顺序呈现:发现SLERT通过与DDX21互作改变DDX21构象进而改变其组装成的环状结构直径,降低与RNA聚合酶的互作,最终促进pre-rRNA的合成,然而实验进行的历史顺序很可能不是这样的!实验数据往往是纷乱的呈现在我们眼前,怎样才能抽丝剥茧缕清线索?笔者浅薄的认知:主线是基于结构的互作传递、产生量变引起生命活动的变化!对于这篇文章:SLERT、DDX21的量分别与pre-rRNA正、负相关,这种量的相关性来源于互作 - SLERT“包裹”DDX21,DDX21“包裹”RNA聚合酶,RNA聚合酶“包裹”rDNA。
Xing Y H, Yao R W, Zhang Y, et al. SLERT, Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017, 169(4):664.
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