【CNS前沿文献追踪】– 电穿孔 + HDR + CRISPR Cas9用于基因编辑

北京德泉兴业商贸有限公司

2018/07/23 16:41
TA的动态

此次分享的是一种新的技术组合，将人们熟知的技术：电穿孔、同源介导修复、CRISPR Cas9放到一起编辑T细胞，具体如下：

DNA链对于细胞是有毒性的，会降低细胞活力，不同类型的DNA链毒性不同：ssODN-寡聚脱氧核苷酸、RNP-CRISPR Cas9核糖核蛋白、Plasmid-质粒、dsDNA-线性双链DNA

作者的策略是在要导入的序列两端加入与整合位点同源的序列，利用细胞自带的同源介导修复机制（HDR-用于修复细胞内偶发的DNA损伤）将新片段定点整合到基因组中以降低毒性

RNP + dsDNA HDR + 电穿孔的方法能够高效、安全的把GFP序列导入并表达

验证通用性：新方法能有效用于各种类型的样品

验证通用性：设置不同的位点，导入GFP，细胞层面没问题，可以表达GFP

验证通用性：设置不同的位点，导入GFP，不同位点对应的亚细胞定位不同，显微镜空间角度验证-GFP的表达位置和靶序列对应蛋白亚细胞定位一致

BATF是个转录因子，会结合到特定的DNA位点，CUT＆RUN法（类似CHIP的方法）验证GFP和BATF一起定位到了BATF结合的DNA位点，暗示新方法准确的将GFP基因整合到了BATP基因

选取匹配的同源序列，如上图，用CD4同源序列新方法可以“靶向”编辑混合细胞中的特定细胞亚群CD4 T细胞，不影响CD8 T细胞（RAB11A两种细胞都表达，用它的同源序列转CD4和CD8都会表达GFP）

可将两个不同基因同时导入一个位点

可将两个不同基因同时导入同一个细胞的不同位点

可将3个不同基因同时导入同一个细胞的不同位点

前面只是单方面的看到了可把目的序列靶向整合，但是否存在脱靶不知道，用targeted locus amplification (TLA) sequencing看是否会脱靶-无脱靶

RNP（CRISPR Cas9）的作用是切开靶序列，做了“脱靶”的RNP，发现即便切开了错误的位点，但由于同源介导修复模板（HDRT）的存在也不会发生脱靶

前面是以GFP为模型从各个角度证明方法的有效性，可用于编辑基因，开始在别的模型上看该方法用用于治疗疾病的可能：关注IL2受体突变，这个突变会造成IL2受体表达降低，IL2功能受限

设计HDR


能够校正IL2受体表达缺陷


校正IL2受体后，IL2信号得到恢复

换一个模型看该方法的能用于治疗：让T细胞表达识别特异抗原的TCR

In vitro，编辑出的TCR-T能够响应肿瘤细胞刺激分泌细胞因子、杀死肿瘤细胞


In vivo，编辑出的TCR-T能够抑制肿瘤生长

 

没有什么新的点，只是把旧有技术做了一个组合（同源介导修复、CRISPR Cas9、电穿孔），但故事讲的好 - 以病毒介导整合的随机性、DNA的“毒性”为起点，接着多个角度证明方法的有效性，最后将方法和实际结合，落脚在当下的热点肿瘤免疫！技术和发现就在那里，决定高度的是你能看多远......

 

Theodore L. Roth, Cristina Puig-Saus, Ruby Yu, Eric Shifrut, Alexander Marson et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.[J] .Nature, 2018.

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