【CNS前沿文献追踪】 – MDSC进入肿瘤微环境的一种机制

针对实体瘤肿瘤免疫疗法受限主要来源于两点：1、免疫细胞进入实体瘤微环境受限；2、肿瘤免疫抑制的微环境。此次整理分享的文章发现了免疫抑制细胞MDSC（起免疫抑制作用）进入结肠癌肿瘤微环境的机制，具体内容如下：

先造模，作者想研究KRAS突变（G12D）对肿瘤免疫的影响，设立了两组：iAP组-未突变结肠癌，iKAP组-Dox诱导KRAS突变的结肠癌（GFP是诱导突变时导入的报告分子）。镜检和组织切片反映两类肿瘤细胞在小鼠体内生长进度相当，iKAP组由于用Dox诱导了突变所以IHC结果会有GFP（报告分子）及p-ERK（MRAS下游）阳性

分别取两组小鼠肿瘤，分析免疫细胞组成，发现iKAP组（KRAS突变）免疫细胞总体浸润高于iAP组，T细胞浸润较少，而MDSC浸润显著高于iAP组，暗示KRAS突变和MDSC、T细胞浸润存在相关性

撤去Dox一周后，KRAS突变消失（IHC图上GFP不再表达），T细胞浸润增加，MDSC浸润减少，再次暗示KRAS突变会抑制T细胞浸润、促进MDSC浸润（流式、IHC两种方法确认）

T细胞中Treg和MDSC一样发挥免疫抑制的作用，KARS突变后进一步分析Treg发现Treg浸润也减少，突变消失后Treg浸润恢复。在TCGA数据库里挖掘数据发现，在人结肠癌上KRAS突变后Treg浸润也会减少，暗示KRAS突变肿瘤中MDSC是发挥免疫抑制作用的细胞

MDSC高表达免疫抑制性分子ARG1和iNOS，会抑制T细胞增殖、分泌IFN-γ

正着看完MDSC可以抑制T细胞后又反着看：抗体敲除MDSC后T细胞浸润增加

上面的数据充分说明KRAS突变会引起MDSC浸润增加，进而抑制T细胞浸润、增殖、发挥效应，那KRAS突变通过什么对MDSC产生的影响呢？作者选用ingenuity pathway analysis (IPA) of RNA sequencing (RNA-seq) profiles这种基因组学大数据方法比对KRAS突变后肿瘤细胞自身信号通路的变化：发现KRAS未突变组iAP IFN-γ及IFN-α通路高于iKAP组

iKAP组撤去Dox后对RNA测序结果进行IPA分析（由于撤去了Dox，KRAS突变消失，会有一些通路发生上调），发现IFN-γ及IFN-α通路在KRAS突变消失后上调明显

qPCR结果也说明撤去Dox，突变消失后IFN通路出现上调，暗示KRAS突变和IFN通路存在关联

再进一步，作者想筛出KRAS突变后所抑制IFN通路的核心基因，将三类变化的基因(i) IFN-α and IFN-γ signature genes (n = 223); (ii) differentially expressed, invasive versus non-invasive (n = 5,727); (iii) mutually exclusive with KRAS mutation (n = 56)进行了交叉比对，找到了IRF2

对TCGA数据库中肿瘤细胞基因变化进行了筛选，也发现伴随KRAS突变IRF2出现deletion

基因层面筛出KRAS突变会使IRF2下调，在组织蛋白层面进行验证发现：KRAS突变后IRF2表达下调，撤去Dox解除突变IRF2恢复表达，暗示KRAS突变会抑制IRF2

相当于找到了KRAS突变的“下游”IRF2，那IRF2的下游呢？作者让细胞过表达了IRF2，看哪些基因表达出现上调，上调的基因包括IFN signaling molecules (STAT1, STAT2, IRF9, IRF7), host defense-related regulation of immunity (RTP4, IFITM1, IFIH1, IFI44, PARP14, NMI, SAMD9L), antigen presentation (PSMB9, PSMB10, B2M), cell death (CASP7, CASP1)，此外ChIP-seq发现很多IRF2结合的位点和IFN通路对应，暗示IRF2是KRAS突变影响IFN通路的主要调节者

做了这么多实验发现KRAS突变会使MDSC浸润增加，KRAS突变抑制IRF2，那IRF2和MDSC浸润是否相关呢，做新的实验：在体外，撤去Dox后MDSC迁移减少，让细胞表达IRF2后MDSC迁移也减少，初步说明IRF2和MDSC迁移存在相关性

刚刚正着看到IRF2抑制MDSC迁移，开始反着看，沉默IRF2后，体外MDSC迁移能力提升，体内也观察到MDSC浸润增加，暗示IRF2对MDSC浸润存在调节作用

是什么将肿瘤细胞内部的IRF2和MDSC细胞联系起来的呢？细胞因子、趋化因子对于免疫细胞召集起重要作用，文章作者将突变后RNA-seq发现的表达发生上调的细胞因子、趋化因子和IRF2 ChIP-seq发现的IRF2结合的细胞因子、趋化因子基因交叉比对，发现CXCL3启动子上有IRF2的结合位点（E），过表达IRF2后结合的CXCL3增加（F）。进一步验证实验发现撤去Dox，KRAS突变消失后CXCL3表达下调，在肿瘤细胞上表达IRF2也会使CXCL3表达下调– KRAS突变抑制IRF2，IRF2抑制CXCL3，KRAS突变促进CXCL3的表达

有一系列趋化因子可召集MDSC，但KRAS突变后只有CXCL3上调最为明显，暗示CXCL3发挥召集MDSC的作用

沉默肿瘤细胞的CXCL3后MDSC向肿瘤细胞条件培养基迁移显著减少，向培养基中加入重组的CXCL3后MDSC的迁移显著增加，再次暗示CXCL3对MDSC迁移存在调节作用

CXCL3的受体是CXCR2，免疫荧光检测发现MDSC的确表达CXCR2，用抗体或小分子阻断CXCR2后MDSC的迁移显著减少

体内实验发现用小分子SX-682阻断CXCR2后MDSC浸润减少，T细胞浸润增加，同时还使肿瘤细胞减少

至此初步理出了一条线路KRAS突变会抑制IRF2，IRF2通过抑制CXCL3分泌抑制MDSC通过CXCR2的浸润，作者开始把这条线路中的角色摘出来一个一个的验证，首先是IRF2，选取MC38细胞系（KRAS通路正常，IRF2表达正常）、MC38K为KRAS突变细胞（可见ERK磷酸化的上调，IRF2表达受抑制）、MC38KI（KRAS突变同时强制表达IRF2，三种细胞中IRF2水平最高），可见KRAS突变后（MC38K组）IFN通路受抑制、CXCL3表达增加、MDSC浸润增加，突变KARS细胞强制表达IRF2后（MC38KI组）IFN通路回调、CXCL3表达下调、MDSC浸润减少

强制表达IRF2除可减缓MC38K肿瘤的生长速度、延长小鼠存活时间外，还可以提高MC38K肿瘤对PD-1疗法的敏感度

看IRF2之外另一关键节点CXCR2，可见用小分子SX-682阻断CXCR2对肿瘤免疫、肿瘤生长抑制、小鼠存活存在积极作用

综上，作者理出了这样的机制：KRAS突变抑制IRF2后，CXCL3的抑制被解除，表达上调，召集MDSC抑制杀伤性T细胞，这一结论是由小鼠模型推导得来，为放大研究的意义，在人的样品、数据库中又挖掘了一番 - KARS突变肿瘤IRF2表达低、对PD-1疗法的响应与IRF2表达正相关

以往我们只关注肿瘤细胞本身，挖掘肿瘤细胞相较正常细胞到底哪出了问题，如：哪个蛋白突变了、哪条通路过度激活了、哪条通路受抑制了，找到肿瘤身上的问题之后试图直接在肿瘤细胞上进行纠正。肿瘤免疫疗法是一种新的视角，在和肿瘤细胞这台戏里我们又引入了新的角色-免疫细胞，这篇文章从这个视角出发去挖掘肿瘤细胞本身发生的“变化”对新角色免疫细胞产生的影响，工具、方法、模型其实就那么多，掌握这些只是必要的开始，更重要的还是讲故事的人的思维、视野。

Wenting Liao, Michael J. Overman, Adam T. Boutin, et al. KRAS-IRF2 Axis Drives Immune Suppression and Immune Therapy Resistance in Colorectal Cancer [J].Cancer Cell, 2019.

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