病毒,可以是恶魔,也可以是工具
病毒的数量与感染性测定
病毒蚀斑实验
tcid50法
免疫染色法
输
问题:无论是plaque assays还是tcid50,均涉及较多微孔的细胞计数或阴/阳性孔判断,常规的显微镜观测法,操作不便且对研究者伤害较大。因此biotek为大家提供了更加自动化的解决方法:通过cytation/lionheartfx自动化成像设备进行cpe或者plaque的成像及计数。
疫苗研发生产中的应用
疫苗效力评价最有效的方法是中和抗体水平检测及中和抗体活力评价。
普通病毒疫苗效果的评价,可以通过收集减毒或灭活病毒疫苗免疫后人或动物血清,与自然源性病毒进行中和抑制试验,以检测中和抗体效价及中和抗体活力。
中和抗体的原理是抗体与相应的病毒粒子特异性结合,使病毒丧失感染细胞的能力,一般采用的是固定病毒—稀释血清法。
固定病毒—稀释血清法
将不同稀释度的血清与固定量的病毒(200tcid50、eid50或ld50)混合,一般37°条件下感作一定时间以后(通常为1h),再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物,每一稀释度接种3~6只(个、管)试验动物(或鸡胚、细胞),记录每组样品的动物死亡数、累积死亡数和累积存活数,按此前提到的reed-muench法或karber法计算其半数保护量(pd50),即该血清的50%中和效价(pd50)。
可见,对于抗病毒疫苗中和抗体的测定方法中,最终的检测指标也可以用cpe计数、或荧光标记的病毒灶来评估,而完整的中和抗体检测需要测定大量的细胞样本,通常要对整板96孔板的整孔进行观测。这样的应用中,biotek能够建立标准化的实验方案流程,样品的拍摄、病灶的分析计数到结果的输出可以自动完成:
抗病毒药物筛选相关应用
针对不同种类的病毒,科学家们的前期工作已经积累了较多的筛选策略,比如,对于目前来势汹汹的冠状病毒,在抗击sars及mers的经验中对于此类cov新药的主要靶点可以围绕cov表面结构的棘突糖蛋白、靶向宿主受体的单克隆抗体、进入途径有关的宿主蛋白酶抑制剂、以cov复制结构基因为靶点的sirnas等(zumla a, nature reviews drug discovery, 2016, 15(5): 327.。
对于hiv等逆转录病毒,研发策略可倾向于受体拮抗剂、整合酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂这些方向;对于hcv病毒可采用rna复制酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等(nature reviews drug discovery 6, 1001-1018)。
基于微孔板的高通量及高内涵筛选平台为以上策略提供了灵活的解决方案,比如下面这篇文章,可以为大家提供一些基于微孔板筛选抗病毒药物的思路,
文中选择的靶点是ns3解旋酶,hcv解旋酶是一种蛋白酶,位于病毒多功能非结构蛋白3 (ns3)的c端三分之二。因此,抑制解旋酶可作为抗生素或抗病毒药物。
构建hcv ns3h(ns3 lacking the protease domain),使用dna寡核苷酸序列代替rna序列,通过fp、htrf和alphascreen筛选能够抑制ns3-dna复合体形成的化合物。这是一种比较新颖的思路,采用抑制dna复合物的方法来筛选hcv解旋酶抑制剂。所用的化合物库来自sigma’s library of pharmacologically active compounds (lopac)。
上图展示了基于荧光偏振的筛选思路以及得到的4个候选化合物剂量效应曲线。
文章展示了使用多功能微孔板检测设备在筛选hcv抗病毒药物的有效性,并且表明其采用的这三种方法均是较为成熟的商品化方案,篇幅所限,感兴趣的老师可以在原文中阅读其他方法的筛选结果和思路。
biotek为大家提供的synergyneo2是顶尖的微孔板药物筛选平台,能够快速高效的实现以上的荧光分子互作的筛选技术平台。
病毒的临床诊断
输
值得一提的是,当下新冠状病毒2019-ncov的临床诊断虽然主要依赖核酸检测,但是由于核酸检测的取样位置、患者的免疫状态等原因,单纯依靠荧光定量pcr的核酸检测有一定的局限性。目前,已经有试剂公司开发出针对新冠状病毒的igm和igg抗体检测elisa试剂盒,能够为临床提供血清学诊断辅助证据,可联合核酸检测方法进行使用。
上图:synergyh1多功能微孔板检测仪,能够支持elisa、trfia、lia等多种模式的免疫检测。
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