案例介绍
客户样本细胞采用病毒转染,其中病毒有GFP荧光,检测时发现阳性比例62.61%,而荧光显微镜下则是满视野的带绿光细胞,而且荧光非常强,但流式图中显示的GFP+细胞比例似乎不够,同时荧光并非特别强,下图为客户端的原始分析图片,于是前往“流式错题集”医院看病。
小贝问诊答疑
01
该样本的检测结果图,直观上我们就可以找出来一个问题,那就是阈值设置不够完美,有太多碎片和死细胞,所以检测时可以手动改变下阈值,如下图,让散点图结果更干净。
02
散点图中SSC的电压设置不够合理,客户将SSC电压设置太高,导致细胞颗粒跑出了上方显示范围,如下图,所以应该降低SSC电压,让细胞群处在图上显示范围。
03
散点图中P1门位置值得商榷,为什么P1门不将如下散点图中深红色圈内细胞圈起来分析?经过询问,客户从以往经验来说,觉得SSC比较大的细胞不能圈,故而P1门只圈了一小部分SSC较小的细胞。
客户说的是有道理的,通常SSC较大的颗粒很大可能性是黏连的细胞,但经验归经验,我们实地做一个单细胞常规检查看看,如下图散射光图中将P1门增大后,多圈出来的细胞在FSC-A和FSC-H的黏连体识别图上,其实仍然处于单个细胞所在的区域,见下图蓝色箭头。
所以对该标本,我们应该优化P1门以及P2门的位置,优化完后我们下一步看看最后一张图,也就是GFP荧光检测的FITC与SSC的散点图,如下图,可见右上角一群带非常强的GFP荧光信号细胞群出现了,如下图蓝色箭头,所以到此,大家看明白了吗?
小贝处方
通过以上分析,该案例已经足够清晰,P1门的画法不当,导致了部分SSC较大的细胞未被选择用于分析,而这部分细胞即是GFP强阳的转染成功细胞,所以导致P3门圈中的GFP阳性信号百分比结果与荧光显微镜结果不一致。该样本如果重新规范画门,则是下图。
但这幅图还是不够完美的,除了刚才讲的阈值以及SSC通道电压设置不够合理,另外就是FITC通道GFP阳性已经超出右边坐标轴最大刻度值,所以在上机获取数据时应该降低FITC通道电压,如果荧光太强,降低电压还是无法完成该工作,则建议从厂家购买该通道的ND减光滤片,从而完美解决该问题。
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