揭开中药的神秘面纱（二）：Biacore解析中药治疗新冠机制

2022年，北京大学和武汉病毒所在Acta Pharm Sin B杂志上联合发表了题为《Schaftoside inhibits 3CL^pro and PL^pro of SARS-CoV-2 virus and regulates immune response and inflammation of host cells for the treatment of COVID-19》的文章。找到了一种很有前途的预防和治疗新冠肺炎的候选药物—Schaftoside。

前期已有研究表明3-凝乳蛋白酶样蛋白酶(3CL^pro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(PL^pro)是治疗SARS-CoV-2的抑制剂的结合关键靶点。并且Molnupiravir和Paxlovid已被批准成为第一批治疗SARS-CoV-2的小分子口服药，但由于其价格昂贵，而且要在症状出现后的5天内服用，否则无效。因此本文作者就从此出发想要找到更加有效、平价的抗新冠病毒药物，最终在12种中草药的125个甘草化合物中筛选到了Schaftoside这一有效的天然产物并表现出良好的安全性和药代动力学特性。

为了阐明Schaftoside与3CL^pro和PL^pro的结合机制，作者首先就利用Biacore-SPR技术对Schaftoside与3CL^pro和PL^pro的结合特异性进行检测，将3CL^pro和PL^pro利用氨基偶联的方式固定在CM5芯片上，Schaftoside以流动相的形式流过芯片表面进行检测。结果显示Schaftoside与3CL^pro和PL^pro结合，K_D值分别为12.4和13.2 μmol/L。

接下来，为了验证结晶实验获得的多个关键氨基酸位点，作者对这些位点进行了定点突变，并同样利用了Biacore检测了Schaftoside与多种突变体的结合亲和力，随后也对其进行了酶活的测定。对于3CL^pro H41A突变体，Schaftoside的抑制率为50.9%，显著低于野生型（67.5%）；突变体G143A和R188A的抑制率分别大幅下降至32%和40.3%。与此同时，作者也对PL^pro 的K157A、E167A和Y268A进行了定点突变，检测了其与Schaftoside的亲和力和酶活。结果表明Schaftoside可以与所有三种突变体结合，尽管Y268A的作用比野生型弱4倍左右；Schaftoside对Y268A具有较低的抑制活性，抑制率为33.7%。Schaftoside与K157A和E167A的抑制活性分别降低至52.3%和53.3%（如图1）。并且酶活检测数据SPR检测结果是保持一致的。综上所述，Y268、K157和E167是与Schaftoside结合的关键氨基酸残基。

同样是开发针对3CL^pro和PL^pro靶点治疗新冠病毒的抑制剂，河北医科大学药学院等单位在Frontiers in Bioscience-Landmark杂志上发表了题为《Effective inhibition of coronavirus replication by Polygonum cuspidatum》的文章。在中药虎杖中找到了有效成分—白藜芦醇苷及白藜芦醇，可以作为一种潜在的治疗新型冠状病毒感染的广谱抑制剂。

已有研究表明轻症和普通症的患者早期使用中药可迅速改善症状，缩短住院时间，减少轻症和普通症的重症转化。在抗SARS-CoV-2的研究中，虎杖就被推荐为新冠肺炎的治疗药物。本篇文章作者就在此基础上确定了虎杖中治疗冠状病毒感染的有效成分—白藜芦醇苷及白藜芦醇。

作者首先在细胞水平验证白藜芦醇苷及白藜芦醇对新型冠状病毒的抑制作用分别为420.6 µmol/L 和 182.4 µmol/L，接着就利用了Biacore在分子层面验证了它们之间的结合亲和力。作者将SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV的3CL^pro和PL^pro蛋白以氨基偶联的方式固定在CM5的芯片表面，白藜芦醇苷及白藜芦醇作为流动相流过芯片表面，检测其结合亲和力和动力学。

结果显示：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV的3CL^pro和PL^pro与白藜芦醇苷结合表现出强烈的剂量依赖性反应，K_D分别为16.01 μM、5.428 μM、16.44 μM、39.53 μM、1.976 μM、7.745 μM（如图2所示）；SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV的3CL^pro和PL^pro同样也与白藜芦醇表现出了强烈的剂量依赖性反应，K_D分别为0.9812 μM、92.51 μM、7.312 μM、12.35 μM、1.556 μM和6.1 μM（如图3所示）。综上所述，白藜芦醇苷和白藜芦醇对SARS-CoV-2、SARS-CoV 3CL^pro和PL^pro蛋白有特异性亲和力，可通过与3CL^pro活性中心和PL^pro蛋白结合抑制病毒复制。

中药连花清瘟（LHQW）胶囊已被临床证明对治疗新型冠状病毒感染的新型冠状病毒肺炎是有效的，其通过显著抑制新型冠状病毒在细胞中的复制，抑制宿主细胞炎症因子的表达，从而发挥抗新冠病毒活性的作用。2021年，海军医科大学药学院联合福建省创新药物靶点研究重点实验室等单位在Acta Pharmaceutica Sinica B杂志上发表了题为《Identifying potential anti-COVID-19 pharmacological components of traditional Chinese medicine Lianhuaqingwen capsule based on human exposure and ACE2 biochromatography screening》的文章，揭示了LHQW中的活性成分及其抗COVID-19的药理机制。

本篇文章研究思路如下（如图4所示），作者首先采用高分辨质谱仪（HRMS）和数据库挖掘相结合的方法，对反复给药后的人血浆和尿液中LHQW的成分谱进行分析，检测出了132种LHQW的原型成分和代谢产物成分。随后综合ACE2生物色谱法筛选得到的数据，共鉴定出了8种直接与人接触且具有潜在ACE2靶向能力的活性成分，并利用Biacore验证了这8个候选活性成分与ACE2重组蛋白的亲和力。

SPR是唯一被收录进中、美、日三国药典并被推荐使用的非标记分子互作技术，是检测药物靶标相互作用的金标准。本篇文章正是利用Biacore-SPR技术首次揭示了基于LHQW胶囊原型成分及代谢产物的有效组分治疗COVID-19患者的分子机制，同时也证实了该方法在鉴别中草药的药物活性成分方面的实用性。

综上所述，现今中医药界的焦点问题是阐明中草药中的有效成分，这是探索中药的核心问题，既是保证中药质量安全的基础，也是未来中药的发展方向。而在攻克这一核心问题的过程中大家都不约而同的选择了Biacore—SPR技术作为攻克这一问题的关键利器。

其实至今为止，Biacore不仅在中草药活性成分鉴定方面大放异彩，也在中草药靶点发现，中药理作用机制解析等基础科研领域同样表现出色，帮助我们的研究人员完成了一个又一个的重大突破，所以Biacore早已成为了我们基础科研和药物研发的利器，成为了工业和科研互作领域中的检测金标准，推动了人类健康事业的发展。

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1. Chen X, Wu Y, Chen C, Gu Y, Zhu C, Wang S, Chen J, Zhang L, Lv L, Zhang G, Yuan Y, Chai Y, Zhu M, Wu C. Identifying potential anti-COVID-19 pharmacological components of traditional Chinese medicine Lianhuaqingwen capsule based on human exposure and ACE2 biochromatography screening. Acta Pharm Sin B. 2021 Jan;11(1):222-236. 

2. Yi Y, Zhang M, Xue H, Yu R, Bao YO, Kuang Y, Chai Y, Ma W, Wang J, Shi X, Li W, Hong W, Li J, Muturi E, Wei H, Wlodarz J, Roszak S, Qiao X, Yang H, Ye M. Schaftoside inhibits 3CL^pro and PL^pro of SARS-CoV-2 virus and regulates immune response and inflammation of host cells for the treatment of COVID-19. Acta Pharm Sin B. 2022 Aug 9.

3. Xu H, Li J, Song S, Xiao Z, Chen X, Huang B, Sun M, Su G, Zhou D, Wang G, Hao R, Wang N. Effective inhibition of coronavirus replication by Polygonum cuspidatum. Front Biosci (Landmark Ed). 2021 Oct 30;26(10):789-798.