01
研究背景
作者研究中的片段双抗是一种串联的单链可变片段 (scFv) ,它包含了两个scFv区域的融合,并由一个短肽Linker连接。由于不含Fc区,因此不能用传统的单抗纯化的方法。接下来看看作者是怎么做的吧!
图1:片段双抗结构示意图
02
捕获:Protein L亲和层析
作者在捕获阶段采用Protein L亲和层析,其配基能够特异性的和抗体轻链相互作用结合。首先,将靶向CD19和CD3的片段双抗在CHO K1细胞成功表达后,离心取上清 (CCS) 。接下来,用含50 mM HEPES,120 mM NaCl,pH 7.4缓冲液平衡层析柱,将细胞上清以10 mg单体/mL填料的量进行上样。为了获得最佳的HCP去除效果和目的物的收率,使用ÄKTA avant内置的DoE功能对洗杂缓冲液中不同盐浓度和pH条件进行筛选,最终选取了513 mM Arg·HCl,87 mM NaCl,pH 6.7的缓冲液。此外,再用含有50 mM HEPES,pH 7.4缓冲液冲洗 5个CV ,以降低电导值。为了提高双抗单体与高分子量组分 (HMW) 的分离效果,作者在洗脱缓冲液中加入盐添加剂,通过两步洗脱:
第一步:洗脱中使用含100 mM Arg·HCl且pH 3.0乙酸缓冲液洗下主要为双抗单体组分(洗脱峰1,见下图a),并通过HPLC-SEC进行纯度鉴定(见下图b);
第二步:洗脱中用不含盐添加剂的pH 3.0乙酸缓冲液洗下主要为HMW(洗脱峰2,见下图a)。
通过以上方法获得的洗脱液回收率为81.3%,HCP减少约3000倍,HMW从细胞培养上清液中的66.5%减少到7.1%。
图2:ÄKTA avant层析图谱,(a) Protein L亲和层析的两步洗脱;(b) 通过HPLC-SEC进行纯度鉴定
03
精纯:Capto adhere多模式层析
对于抗体药而言,仅一步亲和层析纯化是远不够的,使用多模式复合填料Capto Adhere能进一步去除内毒素、DNA、聚集体和HCP等。在继亲和层析对片段双抗特异性捕获之后,采用Capto adhere多模式层析的结合洗脱模式进行精纯。用50 mM MES、pH 6.0 缓冲液平衡层析柱,将上一步纯化得到的洗脱液调节至pH 6.0,稀释3倍至电导率6-7 mS/cm,然后上柱。在50 mM MES、300 mM、350 mM、400 mM NaCl,pH 6.0缓冲液中依次洗脱。最终在保障回收率的前提下,去除大量的残留聚集体,将片段双抗的单体纯度从92.3%提高到98.8%,满足工业生产需求。
图3:(a) 通过HPLC-SEC进行纯度鉴定;(b) SDS-PAGE的纯度鉴定
总 结
双抗独特的双靶点结合能力赋予了新的诊疗策略。而其表达情况和结构类型纷繁复杂,给下游纯化工艺带来了一定的挑战。通过ÄKTA avant内置的DoE方法可以大大提高实验条件筛选的效率,从而更加快速地找到最佳工艺条件。本文的两步纯化工艺(Protein L亲和层析+Capto adhere多模式层析),可将HMW和HCP分别降低至<1%和<100 ppm,总收率可达65%,纯度可达98.8%,证明了两步法纯化片段抗体的潜力。
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