一、DNA甲基化概述
表观遗传学是研究DNA序列不发生改变的前提下,基因的表达发生可遗传变化的一门学科。表观遗传修饰的研究内容包含DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、ADP-核糖基化等。DNA甲基化是人类最早发现的表观遗传修饰之一,属于非组蛋白表观遗传现象。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase, DNMTs)的催化下,将一个甲基(CH3)基团共价连接到胞嘧啶的5号碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶(5mC)的过程。哺乳动物体细胞的DNA甲基化主要发生在CpG岛(CpG islands,C指胞嘧啶,G指鸟嘌呤,p指连接CG碱基的磷酸)。研究结果表明,基因调控元件(如启动子)的CpG岛发生5mC修饰会在空间上阻碍转录因子复合物与DNA的结合。因而DNA甲基化一般与基因沉默相关,非甲基化一般与基因的活化相关,而去甲基化一般与沉默基因的重新激活相关。
细胞的表观遗传修饰与细胞代谢、癌症、衰老、心血管疾病及神经退行性疾病等多种疾病相关。受环境,疾病,性别和年龄等因素影响,DNA甲基化水平处于动态的变化过程。不同个体、组织与细胞之间,甚至是同一个体或细胞的不同发育时期,DNA甲基化的程度和状态都可能存在差异。研究表明,DNA甲基化在基因调控、蛋白质表达、胚胎发育、细胞分化、X染色体失活以及疾病和肿瘤的发生、发展等过程中起重要的调节作用。
二、DNA甲基化的常见检测方法
DNA甲基化具有重要的生物学功能,科学家们开发了大量的方法检测DNA甲基化水平。
目前常见的DNA甲基化测定方法包括以下几类:
1. 基因组甲基化水平的分析方法:包括高效液相色谱(HPLC)和高效毛细管电泳法(HPCE)。
2. 候选基因甲基化分析方法:包括甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法(MSRE-PCR/Southern)、重亚硫酸盐测序法(Bisulphite Sequencing)、甲基化特异性的PCR(MS-PCR)、甲基化荧光法、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、以及结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)等。
3. 基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱方法:包括限制性标记基因组扫描(RLGS)、甲基化间区位点扩增(AIMS)、甲基化CpG 岛扩增(MCA)、差异甲基化杂交(DMH)、由连接子介导PCR出的HpaII小片段富集分析、以及甲基化DNA免疫沉淀法等。
三、使用微孔板读板机测定DNA甲基化
1. DNA甲基化检测
DNA甲基转移酶催化甲基基团共价连接到胞嘧啶的5号碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶(5mC),5mC是最早被发现,也是研究最多的修饰碱基,在基因表达调控、生物生长发育和疾病发生等过程中发挥重要作用。5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是在哺乳动物胚胎干细胞和人、小鼠脑细胞中表达的一种修饰,它可以把胞嘧啶羟甲基化。DNA 甲基化水平是一个DNA 甲基化和DNA 去甲基化的动态调控的过程。研究结果表明,5mC可以导致基因沉默或基因表达水平降低,而5hmC作为去甲基化过程的第一步,会导致基因激活或基因表达水平升高。分析5mC和5hmC在不同细胞和基因组不同区域的含量和比例,对于确认健康和疾病的细胞/组织中的甲基化修饰变化具有重要意义。高效液相色谱法(HPLC), 薄层色谱法(TLC)和质谱等基于层析的技术都可以被用来检测5mC和5hmC,但是它们步骤复杂,耗时,且成本较高。
利用微孔板读板机(酶标仪)进行DNA甲基化相关实验测定灵敏度高,特异性好,并且整个操作步骤简易,快速。可以利用Molecular Devices酶标仪,结合DNA甲基化检测分析试剂盒,通过光吸收法或荧光法定量检测不同样本的甲基化DNA(5mC)和羟甲基化DNA(5hmC)。
2. DNA甲基转移酶检测
DNA甲基化是表观遗传学的重要部分,DNA甲基化模式的改变会导致肿瘤及多种疾病的发生,例如在很多肿瘤中都发现DNA甲基转移酶(DNMTs)的表达异常。对DNA甲基转移酶的研究不仅可以揭示DNA甲基化对基因表达调控的机制,对肿瘤等疾病的治疗也具有潜在意义。
作为甲硫氨酸的活性形式,s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl-methionine,SAM)在生物体内的各种代谢过程中起重要作用,参与催化人体内多种不同甲基转移酶,并且与多种甲基转移酶的活性密切相关。SAM作为甲基供体,在甲基转移酶的催化作用下,可以将甲基基团转移到相应底物上,随后生成s-腺苷高半胱氨酸(s-adenosyl-l-homocysteine,SAH)。甲基转移酶通用酶活评价分析方法就是利用这一特性,通过检测SAH的含量变化,从而评估催发反应中甲基转移酶的活力和反应效率等。
Elisa作为传统的方法,存在实验步骤多,需要经过多次洗板、加样、显色等操作步骤,耗时长,结果不稳定等不足。可以利用Molecular Devices酶标仪,结合均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF)的方法检测甲基转移酶,这种检测方法适合几乎所有甲基转移酶和底物的检测,操作步骤简单、灵敏度高且无放射性污染。
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