Affinite分子互作应用案例 | 从丹参中筛选出作用于新靶点TRPC1的化合物迷迭香酸

背景

丹参(Lamiaceae)是用于治胸痹症、心绞痛的传统中药。瞬时受体电位通道1 (Transient receptor potential canonical channel 1, TRPC1)是心肌损伤治疗的重要靶点。

目的

筛选丹参中作用于TRPC1的活性成分。

材料与方法

采用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)，参照Lipinski的五法则，检索丹参化合物库进行初步筛选。然后，以TRPC1蛋白为基础，用AutoDock Vina软件对化合物组进行综合评分。利用表面等离子体共振(SPR)测定了最佳化合物与TRPC1蛋白的亲和力。采用Western blot方法观察最佳化合物对HL-1细胞TRPC1蛋白表达的影响，采用Fura-2/AM检测观察最佳化合物对HEK293细胞钙离子内流的影响。

结果：同源建模

TRPC5蛋白是TRPC家族成员，已知有蛋白晶体结构。TRPC1与TRPC5相似度46.33%。研究者以TRPC5晶体结构为基础，作了TRPC1的同源建模；利用POCASA预测了TRPC1蛋白的活性口袋。

图1  POCASA预测TRPC1蛋白活性口袋。紫色区域代表潜在活性位点

虚拟筛选&分子对接

采用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)，参照Lipinski的五规则【分子量小于500Da；不超过5个氢键供体；不超过10个氢键受体；辛醇-水分配系数（Clog P）不超过5；口服生物利用度大于50%】以及类药性大于0.18，检索丹参化合物库进行初步筛选，从202个化合物中发现有20个化合物有良好的特征参数。然后利用AutoDock Vina软件对这20个化合物进行计算；通过配体受体间形状匹配与结合能量等参数进行评分。分子对接结果显示，其中迷迭香酸（Rosmarinic acid）得分最高。

图2  RosA 与 TRPC1分子对接图谱

亲和力测定

小分子化合物RosA与TRPC1蛋白是否会发生结合呢？研究者采用SPR技术，利用P4SPR分子互作仪对RosA与TRPC1蛋白作了结合验证以及亲和力测量。检测发现，RosA与TRPC1蛋白的亲和力KD值为1.27uM；同时对照组TRPC1蛋白与TRCP1抗体的KD值是0.05 uM；TRPC1蛋白与抑制剂SKF96365的KD值是200uM。结果显示RosA可直接结合于TRPC1蛋白。

图3  RosA与TPPC1蛋白的SPR结合曲线

活性评价

研究者进一步采用Western blot方法观察最佳化合物RosA对HL-1细胞TRPC1蛋白表达的影响，RosA (50uM)可降低HL-1细胞氧-葡萄糖剥夺/再灌注(OGD/R)后TRPC1蛋白水平(417.1%)，而对正常组没有影响。

图4  RosA抑制HL-1细胞OGD/R 损伤后TRPC1蛋白水平

TRPC1蛋白属于离子通道蛋白家族，研究者又采用Fura-2/AM方法检测观察最佳化合物RosA对HEK293细胞钙离子内流的影响，发现RosA可抑制HEK293细胞中TRPC1蛋白介导的Ca2+内流损伤(0.07 Fura-2 Ratio340/380)。

图5  RosA抑制HEK293细胞中TRPC1蛋白介导的Ca²⁺内流

讨论与结论

研究者利用“同源建模-虚拟筛选-分子对接-亲和力测定-活性评价”的方法，从传统中药丹参化合物库中获得了作用于TRPC1的潜在活性成分RosA，推测RosA可能是一种有前景的心肌损伤治疗临床候选药物。

文中“亲和力测定”环节采用了P4SPR个人型分子互作

P4SPR优势

Affinité instruments 的 P4SPR 是一款模块化、个人型的多通道分子互作系统，既可用于生物学机制的解析，也可用于药物筛选的验证。它的模块化设计允许与液流传输系统轻松集成。多通道特性提高了测量精度，其灵敏度允许检测低分子量的小分子。特异性强、灵敏度高且用户友好的P4SPR 系统可以用于快速收集SPR 数据来表征两分子间结合的相互作用，非常适合用于对生物功能背后作用机制的探索以及药物筛选等研究。

参考文献

1,A CD36 ectodomain mediates insect pheromone detection via a putative tunnelling mechanism, Nature Communications,Richard Benton etc.

2, Screening of rosmarinic acid from Salvia miltiorrhizaeacting on the novel target TRPC1 based on the‘homology modelling–virtual screening–molecular docking–affinity assay–activity evaluation’ method, PHARMACEUTICAL BIOLOGY.