在多肽相关研究中，通过固相多肽合成（SPPS）和多肽纯化的方法，我们可以获得高质量的多肽。但是，在实际应用中，特别是在癌症免疫治疗方面，我们通常需要快速获得一批新抗原肽，以缩短药物生产周期，而传统方法耗时长效率低。因此，在保证获得高质量新抗原肽的同时，进一步缩短获得新抗原肽的时间，成为多肽研究新的挑战和目标。
传统研究方法中多肽合成和纯化两个流程是分开进行的。对于需要一次获得大量的新抗原肽而言，传统固相多肽合成（SPPS）方法批量合成多肽的过程耗时较长，而且，传统的多肽纯化方法——高效液相色谱法（HPLC），单次只能纯化一个多肽，批量多肽的纯化需要依次进行，并且大多数新抗原肽是中长肽或疏水性强的复杂多肽，这对HPLC而言是一大挑战。所以，传统多肽研究方法获得大量新抗原肽的总体效率和质量都不高。
本文提出一种肿瘤新抗原肽合成和纯化一体化解决方案，1该方案在同一台仪器上将多肽合成和纯化的过程结合，利用一种全新的多肽纯化方法，实现高通量复杂多肽的平行纯化。这种一体化解决方案，一方面可以极大缩短批量获得新抗原肽的时间，不到24小时即可获得6个纯化后的多肽，另一方面还极大提高复杂肽纯化的纯度和质量，单次纯化平均纯度高达84%。
PurePep解决方案关键点
1 感应加热合成多肽
本研究选择了17个不同疏水性和长度的新抗原肽（P01-P17），包括6个已有文献记载的合成和纯化都具有很大挑战性的困难多肽（P12-P17）。2,3合成（0.1mmol）步骤如下：
偶联：加入DIC/Oxyama，90℃条件下反应3分钟；
封端：加入Ac2O/Pyr，50℃条件下反应2分钟；
Fmoc-脱保护：加入DMF/Pip，90℃条件下反应1分钟。
表 1 本研究中使用的新抗原肽序列。*指在室温下进行的合成
2 自动PEC多肽纯化
PEC-Linker在同时加入Oxyma/DMF条件下，60℃反应15分钟；
TFA切割常温下进行2小时（83:5:5:5:2 TFA/H2O/PhSH/EDT/TIS）;
PEC纯化常温下进行5.2小时（通用性方法）。
表 2 所有新抗原肽合成后产量和纯度以及使用PEC纯化后产量和纯度（UV280）
3 利用HPLC进行精纯
Knauer Semi-prep. HPLC，15×2 cm C18柱；
2ml Loop进样环，10-60％MeCN 30分钟。
表 3 P12-P17肽在使用感应加热-SPPS（IH）、IH+PEC、IH+HPLC和IH+PEC+HPLC后获得的纯度（UV280）。绿色表示IH-SPPS+HPLC具有更高的纯度。3
PurePep解决方案优势
1 PurePep Chorus快速合成多肽
PurePep Chorus（图1）结合感应加热进行多肽合成（IH-SPPS），并且支持同一台仪器上进行多肽切割和纯化；
利用感应加热每个合成循环17分钟（图2），每组5-6个肽的合成总时间为2.5-7.4小时（包括封端）；
感应加热可合成常温合成失败的多肽（表3）。
图 1 PurePep Chorus全自动多肽合成仪
图 2 反应器感应加热
2 PurePep Chorus自动纯化多肽
使用PEC自动试剂盒（图4）进行PEC正交纯化，获得PEC级肽，平均纯度达到84%，高于HPLC（表2）；
PEC纯化法（图6）允许使用DMSO或HFIP溶剂，从而可以进行从SPPS到纯化的可靠处理；
在5.2小时内自动纯化6个多肽，纯化后的多肽仪器可自动收集（图5），全过程实际手动操作的时间仅为36分钟；
PEC纯化后结合HPLC进行精纯（表3），平均纯度大于90%，包括报道的低合成效率低纯化效率序列。
图 4 PEC自动纯化试剂盒套件
图 5 加载琼脂糖的45 mL反应器，左侧的收集瓶可收集纯化的多肽
PurePep EasyClean（PEC）详细流程
图 6 PEC多肽纯化化学反应步骤，利用通用PEC-连接子系统连接目标肽以及“Catch & Release"技术无痕安全释放目标肽。
参考文献
1. R. Zitterbart et al. Chem Sci 2021, 12, 2389
2. N Hilf et al. Nature 2019, 565, 240
3. N. L. Truex, B. Pentelute et al. Sci Rep 2020, 10, 723
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