微生物菌种的冷冻干燥和-80℃低温冷冻保藏

上海亿倍实业有限公司

2016/06/21 15:58

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微生物菌种的冷冻干燥

1.冻干管的准备选用中性硬质玻璃，95*材料为宜，内径约50mm，长约15cm，冻干管的洗涤按新购玻璃品洗净，烘干后塞上棉花，可将保藏编号，日期等打印到纸上，剪成小条，装入冻干管。121°C灭菌30min。

2.菌种培养将要保藏的菌种接入斜面培养，产芽孢的细菌培养至芽孢从菌体脱落或产孢子的放线菌、酶菌至孢子丰满。

3.保护剂的配制选用适宜的保护剂按使用浓度配制后灭菌，随机抽样培养后进行无菌检查，确认无菌后才能使用。（糖类物质需要用过滤器除菌，脱脂牛奶112°C，灭菌25min。）

4.悬菌液的制备吸2～3ml保护剂加入新鲜斜面菌种试管，用接种环将菌苔或孢子洗下振荡，制成菌悬液，真菌菌悬液则需置4°C平衡20～30min。

5.分装样品用无菌毛细管吸取菌悬液加入冻干管，每管装约0.2ml。最后在几只冻干管中分别装入0.2ml、0.4ml蒸馏水作对照。

6.预冻用程序控制温度仪进行分级降温。不同的微生物其最佳降温度率有所差异，一般由室温快速降温至4°C，4°C至-40°C每分钟降低1°C，-40°C到-60°C每分钟降低5°C。要是条件不具备，可以使用冰箱逐步降温，从室温至4°C再到-12°C（三星级冰箱为-18°C）→-30°C→-70°C，也可用盐水、干冰代替。

7.冷冻真空干燥启动冷冻干燥机制冷系统。当温度下降到-50°C一下时，将冻结好的样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直到样品干燥。样品干燥的程度对菌种保藏的时间影响很大。一般要求样品的含水量为1％～3％，判断方法：a.外观样品表面出现裂痕，与冻干管内壁有脱落现象，对照管完全干燥；b.指示剂用3％的氯化钴溶液分装冻干管，当溶液的颜色由红变浅蓝后，再抽同样长的时间便可。

8.取出样品先关真空泵、再关制冷机，打开进气阀使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后打开钟罩，取出样品。先取几只冻干管在桌面上轻敲几下，样品很快疏散，说明干燥程度达到要求。若用力敲，样品不与内壁脱开，也不疏松，则需急需冷冻真空干燥，此时样品不需事先预冷。

9.第二次干燥将已干燥的样品管分别安在歧形管上，启动真空泵，进行第二次干燥。

10.熔封用高频电火花真空检测仪检测冻干管内的真空程度。当检测仪将要触及冻干管时，发出蓝色电光说明管内的真空度很好，便在火焰下熔封冻干管。

11.存活性检测每个菌株取1只冻干管极是进行存货检测。打开冻干管加入0.2ml无菌水，用毛细滴管吹打几滴，沉淀物溶解后（丝状真菌、酵母则需要置室温平衡30～60min），转入适宜的培养基培养，根据生长状况确定其存活性，或用平板计数法或死活染色方法确定存活率。如需要可测定其特性。

12.保存置4°C或室温保藏（前者为宜）。隔时进行检测。

该方法是菌种保藏的主要方法，对大多数微生较为合适、效果较好，保藏时间依不同的菌种而定，有的为几年，甚至为30年。取用冻干管时，先用75％乙醇将冻干管外壁擦干净，再用砂轮或锉刀在冻干管上端划一小痕迹，然后将所划处向外，两手握住冻干管的上下两端向外用力便可打开冻干管，或将冻干管近口烧热，在热处滴几滴水，使之破裂，再用镊子敲开。

微生物菌种-80℃低温冷冻保藏

微生物菌种真空冻干机是在抽真空的状态下让物质在低温下干燥的设备，主要用于微生物制剂和生物活性物质的干燥。菌种保藏室用来对微生物进行真空冻干保藏。微生物冷冻干燥法是长期保藏菌种的较好方法之一。因其便于批量生产、长期保藏成活力高，保藏和运输设备简单而成为一种普遍使用的保藏方法，已广泛应用于保存大部分细菌、真菌和一些病毒。

1.安瓿管或冻存管的准备

用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净， 121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。

2.保护剂的准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10-20%甘油。

3.微生物保藏物的准备

微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。分装时注意应在无菌条件下操作。

4.冻结保藏

将安瓿管或塑料冻存管置于-80℃冰箱中保藏。

5.保藏周期

一般1-5年。

6.复苏方法

从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。