硝酸银染色详细介绍

2015-07-02 08:38  下载量:1

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由于银染的灵敏度很高,可染出胶上低于 1 ng/蛋白质点,故广泛的用在 2D 凝胶分析上。待找到自己感兴趣的蛋白质点后,再通过考染富集该目的点,然后做进一步的肽段指纹图谱分析(PMF)或序列测定。随着质谱技术的不断完善和发展,对银染后的 f mol 级的蛋白质点直接测定已非难事。这里介绍一种可兼容质谱分析的银染方法,实验程序如下: Step Solution (250ml per gel) Gel Type 固定 25ml acetic acid, 100ml methanol 125ml milli-Q water 1mm unbacked 2x15 min 1mm on film or glass support or 1.5 unbacked 2x60 min 敏化 75ml methanol, 0.5g Na2SO3, 17g NaAc, milli-Q water to 250ml 30 min 60 min 漂洗 250ml milli-Q water 3x5 min 5x8 min 银染 0.625g AgNO3, milli-Q water to 250ml 20 min 60 min 漂洗 250ml milli-Q water 2x1 min 4x1 min 显色 6.25g Na2CO3 , 100μ formaldehyde, milli-Q water to 250ml 4 min 6 min 终止 3.65g EDTA, milli-Q water to 250 ml 10 min 40 min 漂洗 250ml milli-Q water 3x5 min 2x30 min 银染注意事项: 1. 很多银染程序都使用了戊二醛(glutardialdehyde),它能提高银染的灵敏度和染色结果的重复性,但是因为戊二醛会修饰蛋白质,从而会影响对蛋白质点的质谱鉴定和分析; 2. 保证所有的染色器皿绝对的干净,可使用玻璃或塑料做染色器皿; 3. 水的纯度对染色结果好坏影响是很大的,至少要用双蒸水(导电率<2μS),有条件的可使用 Millipore water; 4. 染色过程中避免手去接触凝胶,必须戴上一次性手套或无粉乳胶手套; 5. 所用的化学试剂一定是要分析纯 ( AR )。

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