RNA 的制备与分析

2015-11-10 07:25  下载量:1

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要由四种核糖核苷酸组成,即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)。 天然的RNA并不象DNA那样呈双螺旋结构,而是单链线形分子。只有局部区域为双螺旋结构(约占RNA分子的50%)。 RNA分子中的核苷酸至少75个,多的可达数千个。 RNA的分类: (1)信使RNA(mRNA) (2)转移RNA(tRNA) (3)核糖体RNA(rRNA) (4)小rna(snRNA) 常用的RNA分析方法: (1)RT-PCR(Reverse Transcription PCR)(反) 逆转录聚合酶链反应 (2)原位杂交(In situ hybridization) (3)Northern Blot (4)RNA斑点和狭线杂交 (5)S1核酸酶作图法 (6)引物延伸法 一、RNA的提取与纯化: (一)控制RNA酶的活性: 1、控制污染: (1)专用的RNA操作室、专用器械。 (2)操作时戴口罩、帽子、手套。 (3)实验用器皿、吸头、离心管应为新的。 (4)所配制的水溶液,尽可能用DEPC处理。 2、已污染RNA酶的器具的处理 (1)在180℃的高温下干烤8小时或更长时间。 (2)氯仿冲洗。 (3)双氧水浸泡。 (4)0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水浸泡。 3、常用的RNA抑制剂: (1)焦磷酸二乙酯(DEPC):一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂,通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应从而抑制酶的活性。 (2)异硫氰酸胍:最有效的RNA酶抑制剂。在裂解组织细胞的同时,也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中分离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用. (3)氧钒糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,与RNA酶结合后几乎能完全抑制RNA酶的活性。 (4)RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从人胎盘中分离出来,可以和多种RNA酶结合,使其失活。 (5)其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。 (二)RNA的提取: 常用的RNA提取方法: 异硫氰酸胍法、盐酸胍法、RNAzol法。

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