克隆心得:帮助新手快速做出克隆

2015-12-30 07:46  下载量:1

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一、片断平移的克隆(也适用于多片断连接) 简介:将用作载体的质粒A(制作大片断)酶切3μL ,要切出小片断的质粒B酶切7μL;琼脂糖回收胶电泳;切胶回收来自质粒A的大片段,和来自B的小片断,并回收到一管中;酚氯仿法回收DNA,酒精沉淀,干燥;加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ,4℃过夜;次日转化涂板。 酶切 配置可酶切共10μL质粒的酶切反应体系(双酶切): (提示 在克隆设计时尽量使用好切的内切酶<通常是效价高、便宜量大的酶>,且注意这两个酶有比较兼容的Buffer,即在这种公用Buffer中,两酶的效力变化不大<至少保持60%的活性>。酶切体系根据需要,可加入BSA。) 酶切体系 混匀 37℃,酶切3小时。 (提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在10U/μL左右,3μL内切酶相当于30U,足够切10μL的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200-600ng/μL,一般浓度达不到1μg/μL。根据1U酶切1μg质粒的原则,这一酶量是足够的。) 1%琼脂糖回收胶回收(碎胶、酚氯仿抽提法) 1. 酶切产物加入10%量的上样Buffer,混匀。使用1%的琼脂糖回收胶,电泳回收酶切产物。 2. 用手术刀切下所需要的大片断(载体)和小片断(插入片断),收入一个1.5mL离心管中。(提示: 切胶前,需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面,以防污染。 手术刀要火焰消毒,而后切胶回收。)

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