DNA的制备

2015-12-31 07:47 下载量：1

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DNA是生物的主要遗传物质，因而DNA的制备是基因工程的基础。由于生物形式的多样性（细菌、植物、动物），以及DNA在生物体中存在形式的差异（染色体、线性DNA、质粒），因此，制备DNA的过程和方法也不相同。一、DNA在生物体中的存在形式 1．染色体DNA 是生物体遗传信息的主要载体 * 原核生物染色体：结构简单，储存的信息相对较少 * 真核生物染色体：结构复杂，储存大量的遗传信息用途：分离目的基因，研究基因的调控与表达 2．质粒(Plasmid)DNA（染色体外遗传物质）特点：能自我复制，大小不一，在体内以超螺旋形式存在，在体外以超螺旋、开环和线形存在。用途：构建克隆载体，分离目的基因 3．病毒DNA 构建克隆载体，分离目的基因 4．叶绿体和线粒体DNA 构建克隆载体，分离目的基因二、细菌总DNA的制备（Escherichia coli） 1.菌体培养: 将活化的菌体接种于LB(Luria- Bertani)培养基,于37oC培养至对数生长期,然后置冰水浴20min 2.收集菌体: 离心(5000 g, 5 min) (50 ml) 3.菌体裂解: 加5ml冷 TES(0.1 M Tris-HCl,0.1 M EDTA,0.15 M NaCl,pH 8.0)加10 mg 溶菌酶,于37 oC温育10 min 4.去RNA: 加入1 mg RNase.于50oC温育15 min 5.去蛋白: 加入0.6 ml 10% SDS和Protease K(0.1mg/ml),60 oC,30min加苯酚-氯仿抽提(等体积) 6.沉淀DNA: 加入1/10 V 的NaAc, 2 V 无水乙醇以玻璃棒缠绕絮状沉淀,溶于TE Buffer中三、细菌质粒DNA的制备（碱裂解变性法） 1. 菌体培养：将活化的菌体接种于含一定浓度抗生素的LB培养基中，于37℃培养至对数生长期后期，然后置冰水浴20 min。 1) 常用的抗生素及其使用浓度氨苄青霉素：（Ampericillin，Ap）50-150 μg/ml 链霉素：（Streptamycin，Sm）25-50 μg/ml 四环素：（Tetracycline，Tc）10-50μg/ml 氯霉素：（Chlorampenicol，Cm）20-170 μg/ml DNA的制备 3) 质粒的相关概念严谨型质粒：质粒（如pSC101）的复制依赖于宿主细胞提供的蛋白和质粒自身编码的蛋白的共同作用。松弛型质粒：质粒（如pUC系列）的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依赖于由宿主提供的半衰期较长的酶，当蛋白的合成停止时，复制仍然进行。

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文献贡献者

上海士锋生物科技有限公司

铜牌会员 | 第11年

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