从农杆菌分离质粒

2016-01-27 07:51 下载量：1

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、从在含20 mg/l Kanamycin和15 mg/l Gentamycin 6 ml的液体lb培养基中接种Agrobacterium细胞，然后在28℃、200-220 rpm培养24 h。准备进行质粒提取。质粒提取前，检查裂解液（Lysis Solution）是否有沉淀，如果有，要在65℃下溶解。对试剂盒中的稀释溶液（Elution Solution）（用Qiagen公司的EB（5 mM Tris, pH 8.5）代替）置于65℃下预热。二、对培养后的Falcon试管在3600 rpm速度下进行离心12 min，丢弃上清。三、用200 μl 试剂盒中的重悬溶液（Resuspension Solution）对农杆菌沉淀小球进行混匀重悬（蜗旋或用微量移液管上下吹吸）。四、加入200 μl裂解液（Lysis Solution），上下倒置6-8次混匀（从不同方向倒置），直到变混和液变清变粘为止。不要蜗旋，防止对DNA剪切。裂解反应不要超过5 min（最后一个样加后计时2 min可也）。五、加入350 μl 中和/结合溶液（Neutralization/Binding Solution），轻轻上下倒置4-6次混匀，然后在≥12000 × g或最大速度下离心10 min。如果上清中还有大量的悬浮颗粒，须重新离心。六、插入过滤柱（GENElute Miniprep Binding Column），在柱中加入500 μl 柱准备溶液（Column Preparation Solution），在12000 × g转速成下离心30 至1 min。丢弃滤过液。七、将第五步中的上清转移入柱中，在12000 × g转速成下离心30 至1 min。丢弃滤过液。八、在柱中加入500 μl 选择洗液（Optional Wash Solution），在12000 × g转速成下离心30 至1 min。丢弃滤过液。九、在柱中加入750 μl稀释后的洗液（Wash Solution），在12000 × g转速成下离心30 至1 min，丢弃滤过液。然后在最大转速下离心1至2 min。注意：一定要在洗液2（Wash Solution 2）中加入乙醇。十、将过滤下的洗液倒掉，再在最大转速下离心1至2 min，以彻底除去残留在洗液中的乙醇。十一、在柱下装上新收集管，柱中加入100 μl 稀释溶液（Elution Solution)（用Qiagen公司的EB（5 mM Tris, pH 8.5）代替），在≥12000 × g或最大速度下离心1 min。稀释液中的质粒DNA或用或贮藏于-20℃.条件下。十二、取10 μl质粒样品+3 μl载液（6 × DNA load dye）在1% 琼脂糖胶上跑电泳，鉴定质粒提取产量。

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文献贡献者

上海士锋生物科技有限公司

铜牌会员 | 第11年

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