逆转录PCR

2016-06-02 07:38 下载量：1

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聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA（complement DNA）合成（即RNA的反转录（RT，reversetranscription）），同cDNA的PCR结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的基本原理（图4.1）。首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成 cDNA，即总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；然后再利用dna聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。在RT时，有3种引物可选择（表4.1) 。用1）和2）方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用3）方法，先要去http://www.ncbi.nlm.nih.gov查它的序列，并用oligo等软件设计引物。四逆转录PCR (RTRT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法

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文献贡献者

上海士锋生物科技有限公司

铜牌会员 | 第11年

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