从琼脂糖中凝胶中回收DNA片段的技术

2016-06-30 07:33 下载量：1

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掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的技术。 DNA片段的胶回收：电泳洗脱法低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法冻融回收法玻璃奶回收法柱回收法(按说明书进行) 胶回收注意事项：将电泳槽用ddH2O反复清洗干净，倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液; 根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板; 切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶; 要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤; 熔胶要完全。目的基因片段与载体连接实验目的：掌握DNA片段的体外连接技术。 DNA连接酶：能催化双链DNA片段紧靠在一起的5’-P末端和3’-OH末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 1、E.coli DNA连接酶：由E.coli基因lig编码，需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为辅助因子。修复双链DNA上的单链缺刻(nick)，用于连接匹配粘端。 2、T4 DNA连接酶：从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到，由T4基因DNA30编码，需ATP作为辅助因子。修复双链DNA上的单链缺刻(nick)，用于连接匹配粘端; 连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺刻; 连接平端双链DNA分子。 1、修复双链DNA上的单链缺刻，用于连接匹配粘端。带匹配粘端的DNA分子靠近时，自发形成暂时的碱基配对，利于连接酶把紧邻的5’-P与3’-OH连接到一起。不同DNA片断通过匹配粘端的连接。同一DNA片断通过匹配粘端的连接--自身环化。 2、连接RNA-DNA杂交双链中DNA链上的缺刻。 3、连接带平端的双链DNA分子。注意： DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接; 只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick); 不能连接双链中1个或多个核苷酸缺失所致的缺口(gap)。 E.coli DNA连接酶：连接匹配粘端; T4 DNA连接酶：连接匹配粘端、平端。最常用的为T4 DNA连接酶。匹配粘端的连接： 1)哪些情况下会产生匹配粘端?

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文献贡献者

上海士锋生物科技有限公司

铜牌会员 | 第11年

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