琼脂糖凝胶DNA片段回收中的常见问题

2016-07-04 07:49  下载量:1

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1、未回收到dna片段或回收效率很低 A、原因:胶块未完全溶解 建议:为加快凝胶的溶解,应将凝胶置于55度水浴中溶解,期间不断上下颠倒,待确定凝胶完全溶解后再进行后续操作。每100 mg凝胶应加入100uL溶胶液,如果胶块过大,应将胶块切成小块,以便于凝胶溶解。 B、原因:加入溶胶液过少 建议:对于PCR产物,或者酶切产物,应加入2倍体积的溶胶液。对于凝胶回收,每100 mg凝胶应加入不少于100uL溶胶液。对小于200bp的片段应加入5倍体积的溶胶液。 C、原因:DNA Wash Buffer 中未加入无水乙醇 建议:第一次使用前,按照说明书要求加入要求的无水乙醇。DNA Wash Buffer使用后,应旋紧瓶盖,以防乙醇挥发,漂洗时损失DNA,降低回收效率。 D、原因:洗脱缓冲液不合适 建议:洗脱液的pH值在7.0~8.5时,洗脱效率最高,洗脱液pH超出此范围,将会显著影响收获率,请使用试剂盒配套的Elution Buffer(pH 8.5,10mM Tris-HCl),或者使用使用pH值在此范围的ddH2O。 E、原因:洗脱缓冲液未加到离心柱中间 建议:因为在洗脱时使用较少的洗脱缓冲液,洗脱缓冲液应加在中间位置,并室温放置1~2分钟,然后再离心洗脱。另外,采用65度预热的洗脱Buffer将显著提高回收效率。 F、原因:起始回收量太少 建议:如果起始回收量很好的样品,应富集,最好使用不少于1ug的样品。对于PCR产物,应事先电泳检测产量,在进行回收操作。 2、电泳时,产物漂出点样孔 原因:洗脱时,柱子中残留乙醇 建议:在进行洗脱前,如果柱子上残留乙醇,将会影响洗脱效率,在洗脱前应再次离心,或者空气中放置几分钟,再进行洗脱。 3、后续无法进行连接等实验操作 原因:洗脱液中含有乙醇 建议:洗脱前,确保柱子中乙醇已无残留乙醇。

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