DNA重组实验中常用的技术:质粒DNA的提取及鉴定

2016-07-06 07:46 下载量：1

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一、质粒dna的提取及鉴定 (一)质粒dna的提取及鉴定 1.收获细菌 (1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。 (2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。 (3)吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 2.碱裂解法小量抽提质粒 (1)将细菌沉淀[上述步骤(3)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖，25mmol/lTris–HClpH8.0,10mmol/LEDTA)中，剧烈振荡。 (2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/lNaOH,1%SDS)，缓和振荡，水浴5min。 (3)加150μl预冷溶液Ⅲ(50mol/LKAC60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml)，缓和振荡，冰浴5min。 (4)4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。 (5)可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，(4)。 (6)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。 (7)4℃以12000g离心5min。 (8)小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。 (9)用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。 (10)加50μl的1×TE(含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶)，振荡，贮存于-20℃。 (二)质粒DNA的大量制备

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文献贡献者

上海士锋生物科技有限公司

铜牌会员 | 第11年

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