植物基因中的大肠杆菌原核表达方法

2016-07-25 07:38  下载量:1

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1.准备工作(试剂配置和器材准备) 1)操作流程示意图 主要步骤操作 ①制备pET-32a(+)载体 用限制性酶消化,去磷酸化后胶纯化回收 ②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化,再回收 ③插入片段克隆到pET-32a(+)载体 插入片段与pET连接,转化 ④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株 ⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE,Western 印迹、定量分析确定目的蛋白 ⑥放大试验纯化目的蛋白 放大试验,制备粗提物,亲和纯化,切除融合标签 2)配制生长培养基如LB,和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。 3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。 4)感受态细胞的制备,参照其它试验手册。 2.操作步骤 [1] 制备载体 1)载体消化和胶纯化 3μg pET载体 3μl 10×限制性内切酶buffer 10-20U 两种酶(是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%) 3μl 1mg/ml乙酰BSA(根据需要 补足水到30μl 2)37℃温浴2-4h 3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度 4)消化完全后,加入0.05U小牛碱性磷酸酶,37℃ 30min 5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳,切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。 6)-20℃保存备用。 [2]制备插入片段 限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因,克隆进T-载体,然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。但在PCR过程中,需要减少突变的发生,可采用高保真酶,尽量减少PCR循环次数,增加模板和引物的浓度。 [3]在pET32a载体中插入片段

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