如何绘制并验证表达谱

2016-08-01 07:12  下载量:1

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1. qPCR:我们使用过两种方法,miScript SYBR Green System(Qiagen)和TaqMan miRNA assays(ABI)。我们倾向于前者,因为它含有poly-A加尾方法,回避了内源3’端miRNA序列多样性的问题。这种多样性是TaqMan茎环结构反转录引物策略的问题。从技术的角度,单个oligo dT的反转录反应(Qiagen)在费用、移液操作和可变性方面优于茎环结构的反转录。我们在384孔板上开展qPCR分析,每个处理组有四个样品和三次实验重复(总共12个孔),以获得可靠、重复性好的结果。同时还包括无模板、无引物的对照。 2. Northern blotting:我们使用放射性标记的LNA寡核苷酸作为探针,进行miRNA的northern blot。许多miRNA在功能相关家族中发现,这些家族成员的种子序列为100%同源,只有3’端变化。因此,在使用qPCR或northern时,你必须验证分析只检测目的miRNA,而不是其它成员。我们在玉米(Zea)RNA载体背景中加入合成的成熟miRNA(IDT)来验证。 就northern来说,每个miRNA家族成员的合成miRNA在含有8M尿素的15% PAGE胶上进行。优化杂交温度,让LNA探针只与目的miRNA结合,而不与其它成员结合。一旦利用加标策略建立了适当的northern杂交条件,就能应用于实验样品。 3. 原位杂交:我们也利用Exiqon的DIG标记的miRCURY LNA microRNA检测探针,来确认我们的miRNA表达结果和组织特异性。

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