RNA酶保护试验试剂配制、操作流程与注意事项

2016-08-22 07:28 下载量：1

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RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点： 1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。 2. 由于pcr扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。 3. 由于与反义rna探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。 4. 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。 5. RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。 6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。 7. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。 RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备 1. GACU POOL：取100mM atp、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。 2. 杂交缓冲液：PIPES 0.134g、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。 3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml

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文献贡献者

上海士锋生物科技有限公司

铜牌会员 | 第11年

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