PCR常见问题之pcr扩不出条带

2016-09-05 07:14 下载量：1

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PCR实验中常遇见一些令人头疼的小问题，可能就是实验设计或者实验过程中一个小小的条件没有到位，就导致预期的实验结果出不来。下面，我们就来用一个典型的例子，看一看PCR过程中常见的问题之一：pcr扩不出条带。例：首先从乳腺癌细胞MCF-7提取RNA，反转cDNA(09年9月)，-20保存。现在以此cDNA作为模板，扩增雌激素受体基因(ESR1)的全长序列，1788bp,GC含量是57.27%。引物是通过Prime5软件设计的，上游引物Tm =57，下游引物 Tm =62.9，通过Blast比对，确认设计的引物较好的特异性。我选用的两个内切酶分别是XhoI,EcoRI. 内参GAPDH能扩出来，但是不见目的条带，只有几百bp的非特异条带。 PCR体系：模板 1ul 10um引物(上+下) 2ul 2.5mM dNTP 1ul taq酶 0.5 10*buffer (15mM Mg) 2 ddH2O 13.5 PCR的退火温度摸索过53，55，58，无果; 后来看了网上建议用touchdown PCR加热启动，能增强特异条带，还是无果。我怀疑是不是体系的问题?还是需要重新提取RNA，解答：PCR的反应条件和很多参数有着密切的关系。在实验设计中我们要考虑到模板浓度的大小，设计引物时也要主要引物长度适当以及恰当的GC含量，在PCR体系中引物浓度，dNTPs浓度相对要均衡，选取的taq enzyme，缓冲液的离子含量也是影响产物的结果，另外就是要根据产物大小设定适当的变性时间，退火温度及时间，延伸的时间。根据提问者上述的问题建议使用GC buffer，并且可适当调整引物和dNDP之间的比值。

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文献贡献者

上海士锋生物科技有限公司

铜牌会员 | 第11年

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