磷酸钙细胞转染技术

2017-07-10 07:40  下载量:0

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 呈指数生长的真核细胞(如HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纤维细胞) 2 完全培养液(依所用的细胞系而定) 3 CsCl纯化的质粒dna (10~50μg/次转染,二次纯化) 4 2×HEPES缓冲盐水(HeBS) (pH6.95~7.05) 50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH调pH至6.95~7.05,过滤除菌后,-20℃保存备用。 5 2.5mol/L CaCl2过滤除菌,-20℃保存备用。 6 磷酸缓冲盐水(PBS) 7 37℃,5%CO2的加湿培养箱 8 100mm组织培养平板 9 15ml锥形管 [方法与步骤] 1 传代细胞准备 细胞在转染前24h传代,待细胞密度达50%~60%满底时即可进行转染。加入沉淀前3~4h,用9ml完全培养液培养细胞。 2 DNA沉淀液的准备 首先将质粒DNA用乙醇沉淀(10~50μg/10cm平板),空气中晾干沉淀,将DNA沉淀重悬于μL无菌水中,加50μL2.5mol/L CaCl2。 3 用巴斯德吸管在500μL 2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液,同时用另一吸管吹打溶液,直至DNA-CaCl2溶液滴完,整个过程需缓慢进行,至少需持续1~2min。 4 室温静置30min,出现细小颗粒沉淀。 5 将沉淀逐滴均匀加入10cm平板中,轻轻晃动。 6 在标准生长条件下培养细胞4~16h。除去培养液,用5ml 1×HeBS洗细胞2次,加入10ml完全培养液培养细胞。 7 收集细胞或分入培养皿中选择培养。

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