大肠杆菌质粒DNA的提取

2017-07-24 07:15  下载量:0

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一、大肠杆菌质粒dna的提取 质粒dna的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术,但提取方法有很多种,以下介绍一种最常用的方法: 碱裂解法:此方法适用于小量质粒dna的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下: 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml lb培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。 7、以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇,混匀后于?0℃静置10min。 9、再以10,000rpm离心20min,弃上清。 10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中 煮沸法   1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。   2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。   3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。   4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。   5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。   6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。   7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。   8、取20ml进行电泳检查。

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