利用MALDI质谱成像揭示肿瘤-基质之间的相互关系

科瑞恩特（北京）科技有限公司

2024/04/03 17:43

关键词：MALDI-MSI 基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术，breast cancer 乳腺癌，Rho-associated protein kinase (ROCK)：Rho相关蛋白激酶(ROCK)，tumor 肿瘤，stroma 基质，tumor microenvironment 肿瘤微环境，extracellular matrix 细胞外基质，collagen 胶原蛋白

肿瘤的发生涉及到基因修饰和癌细胞与其相邻的正常组织间质之间复杂的相互作用，在乳腺癌中，Rho 相关蛋白激酶 (ROCK) 的条件激活可以通过培养基质和增强细胞外基质的产生和重塑来促进肿瘤的生长和进展。2020年南澳大利亚大学肿瘤生物学研究中心 Sarah T. Boyle 和未来产业研究所 Manuela Klingler-Hoffmann 研究团队联合在 Journal of Proteome Research 上发表了一篇名为“Uncovering Tumor−Stroma Inter-relationships Using MALDI Mass Spectrometry Imaging”的文章，本文利用乳腺癌小鼠模型进行这种相互作用的研究。

作者使用多肽基质辅助激光解吸/电离质谱成像 (MALDI-MSI) 来量化肿瘤及其基质在常规空间背景下发生的蛋白质组学变化。通过液相色谱串联质谱法进行多肽鉴定，通过定量免疫荧光法检测进行肿瘤样品中蛋白表达的验证。本研究最终证明 MALDI-MSI 检测能够定量评估肿瘤-基质之间的相互关系，可以利用复杂的小鼠肿瘤模型来鉴定人类癌症患者潜在的预后因素。

PyMT小鼠乳腺癌模型中ROCK激活产生促肿瘤基质

在转基因 PyMT 乳腺癌小鼠中，作者通过特异性抗体分别观察到了 ROCK 下游通路底物蛋白调节轻链2磷酸化（Mlc2，Ser19磷酸化）和肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1磷酸化(Mypt1, Thr696磷酸化），证明 ROCK 的激活。与 KD-PyMT 相比，ROCK-PyMT 中两种底物磷酸化的信号强度均增加(图1a)。分别用抗 e-cadherin 抗体和 DAPI 标记上皮细胞和细胞核，发现肿瘤上皮细胞内 ROCK 的激活可促进肿瘤的生长，而 ROCK 激活的肿瘤也会促进肿瘤如图中胶原纤维 SHG 成像显示的细胞外基质(图1b)，表明 ROCK-PyMT 肿瘤中总胶原蛋白增强，免疫荧光检测发现基质纤维连接蛋白、骨膜蛋白和肌腱蛋白C均增强（图1c）。

综上所述，图1结果表明，乳腺癌中 ROCK 的激活会使其底物磷酸化，同时会促进细胞外基质胶原蛋白、纤维连接蛋白、骨膜蛋白和肌腱蛋白C的表达，这将导致组织硬度的增加，该结果与之前在皮肤癌中的研究结果相一致。

图1：在PyMT小鼠乳腺癌模型中，ROCK的激活会产生促肿瘤基质

MALDI-MSI技术检测乳腺癌中ROCK激活后多肽的上调

为了对比 ROCK-PyMT 和 KD-PyMT 乳腺癌模型中相关蛋白的空间分布差异，作者进行了胰蛋白酶解肽段的 MALDI-MSI 检测。

图2显示了采用 MALDI MSI 检测 KD-PyMT (红色轮廓)和 ROCK-PyMT 肿瘤模型(绿色轮廓)四个代表性离子强度图像，通过平均离子响应强度谱图对比，以及上述离子的 ROC 曲线分析显示，与 KD-PyMT 相比，ROCK-PyMT 肿瘤中这些蛋白的表达明显上调 (AUC值为0.716~0.858)。进一步采用 LC-MS/MS 鉴定上述离子分别为 m/z 为1296.785（胶原蛋白α-1(I)链）、1171.624（肌动蛋白）、1055.523（Rab14）和1143.683（tubulinβ-4链）。

图2：MALDI-MSI 检测 ROCK 激活乳腺癌中多肽的上调情况

MALDI-MSI检测ROCK调控的ECM，基质介质及其迁徙

作者在 ROCK 激活的乳腺癌中发现了丰富的 I 型胶原蛋白(Col1a1)α 链 (图2a, S2a)。这与前期的观察结果一致，即在乳腺癌细胞中激活 ROCK 会产生促肿瘤的 ECM(图1b,c)。同时用定量免疫荧光法证实了在 PyMT 肿瘤样本中成熟胶原蛋白 I 的表达(图3a)。

本文研究发现 ROCK 激活的乳腺肿瘤较 KD 具有较高的肌动蛋白(图2b, S2b)。通过定量免疫荧光进一步检查，发现 ROCK-PyMT 肿瘤中 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)明显高于 KD 组(图3b)，在基质区域中，α-SMA⁺细胞中 Pdgfrβ 呈阳性，而 Pdgfrβ 是成纤维细胞的标志物，α-SMA 是促肿瘤 CAFs 的标记物，这与前期结果相一致；ROCK-PyMT 肿瘤中 α-SMA 阳性细胞与 Pdgfrβ 阳性细胞的比例明显高于 KD-PyMT 肿瘤(图3c)。

胶原蛋白 I 在 ROCK 激活的肿瘤中丰富存在(图3a)，而在基质区主要与 α-SMA 阳性的成纤维样细胞共存(图3d)，表明这些成纤维细胞可能导致胶原蛋白 I 的产生。在 ROCK 激活肿瘤的上皮区域 α-SMA 阳性显著增加(图3e)，前期已证明 ROCK 的激活可以诱导上皮-间充质转化 (EMT)，而 α-SMA 是 EMT 的标志物，这表明 ROCK 激活的 PyMT 肿瘤中存在更多 EMT 的癌细胞。与 KD-PyMT 相比，ROCK- PyMT 肿瘤中 Rab14 也上调(图2c, S2c)。利用定量免疫荧光技术检测发现，ROCK-PyMT 肿瘤中 Rab14 的表达明显高于 KD-PyMT 肿瘤(图3f)。囊泡和核内体是沿着微管网络运输的，而 Rab14 核内体已被证明与微管相关。

文中 MALDI-MSI 检测显示细胞骨架微管蛋白 tubulin-β4 增加(图2d, S2d)。而 tubulin-β4 是一个潜在的治疗敏感细胞的肿瘤靶点。利用定量免疫荧光法验证 tubulin-β4 的表达发现，其在 ROCK-PyMT 肿瘤中的表达明显高于 KD-PyMT 肿瘤(图3g)。作者结合在 Rab14 上的发现，推测癌细胞中的 ROCK 激活增强了 EMT，增加了 Rab14 核内体沿着微管系统的运输，导致转运酶将 ECM 改造成促进肿瘤形成的形式。

结果表明，可以通过多肽的 MALDI-MSI 检测来识别蛋白在 ROCK-PyMT 和 KD-PyMT 乳腺肿瘤中表达的差异。

图3：免疫荧光可视化检测ROCK调控的ECM、基质介质及其运输

MALDI-MSI检测鉴别差异调节肽的预后及其作用机制

作者研究发现胶原蛋白 I 和平滑肌肌动蛋白均在 ROCK 激活时上调。高胶原蛋白 I 和 SMA 均被证明是乳腺癌和其他癌症不良预后的因素，本文对来自 TCGA 和 METABRIC 两个人类基因组数据库的数据进行了分析，结果表明胶原蛋白I的表达与更多浸润性相关(图4a)。 Kaplan-Meier Plotter 分析显示，COL1A1 或 ACTA2 (α-SMA) 的高表达与雌激素受体阴性乳腺癌患者的低生存率相关(图4b)。 TCGA/METABRIC 数据库与 Kaplan-Meier Plotter 数据分析的 COL1A2 在人类乳腺癌进展和生存中的表达结果相似 (图S3)，表明可以通过 MALDI-MSI 检测相关小鼠模型来确定人类癌症进展的潜在预后因素。

为了证明 MALDI-MSI 检测有利于后续的机制分析，同时考虑到已经发现胶原蛋白 I 和 α-SMA 水平的增加和在整个组织水平上的共定位(图3a,b,d)，作者进一步研究了癌细胞中的 ROCK 活性如何通过旁分泌信号将 CAFs 诱导为促肿瘤的形式，与将从 PyMT 肿瘤中提取的原代成纤维细胞在 KD-PyMT 细胞培养基中的结果相比，在 ROCK-PyMT 细胞培养基中的前胶原蛋白 I 和 α-SMA 均显著增加 (图4c)。这表明 ROCK 激活细胞的条件培养基会使成纤维细胞呈现出促肿瘤形式并开始胶原蛋白的生物合成。

图4：MALDI-MSI检测鉴定差异调节肽的预后及其作用机制

研究结论

本文利用 MALDI-MSI 检测和 LC -MS /MS 检测相结合的方法鉴定了双基因乳腺癌 ROCK 激活小鼠模型中的差异调节蛋白，MALDI-MSI 检测技术首次被用于研究肿瘤-基质相互作用的机制。在乳腺癌细胞中鉴定并验证了四个在 ROCK 激活时上调的关键蛋白，即胶原蛋白 I 、α-SMA，Rab14 和 tubulin-β4，这些 ROCK 下游蛋白的上调表明，癌细胞中的 ROCK 能够通过将成纤维细胞重编程为促肿瘤的 CAF 形式来间接改变其环境，从而重塑 ECM 和诱导癌细胞中的 EMT，利用微管网络运输核内体中的重塑酶来直接重塑 ECM。本文也进一步强调了 MALDI-MSI 检测技术在人类癌症进展中确定预后遗传因素方面的应用潜力。

文献地址：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.0c00511?fig=fig4&ref=pdf

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