癌症是世界上死亡率最高的一种疾病,如果不能在早期阶段被诊断出来,会使病人陷入长期痛苦的治疗过程或逐渐死亡。然而,对于早期癌症的筛查,仍然缺乏一种速度快、成本效益高、敏感性强的检测手段。实现这种技术的困难在于,癌症是由各种遗传因素和表观遗传改变引起的,比如基因突变,肿瘤来源的DNA片段,称为循环肿瘤(ct)DNA,可以在癌症患者的血液中被发现,但只占细胞游离(cf)DNA的一小部分。在癌症的早期阶段和健康个体中,cfDNA的浓度非常低,健康个体的血浆cfDNA浓度在1.7 ng/mL到30.8 ng/mL之间。为了区分肿瘤来源的DNA和健康细胞的野生型DNA,必须对某些基因的DNA序列进行突变分析。
PIK3CA基因比较容易发生突变且存在PIK3CA突变的肿瘤一般预后不良,因为PIK3CA基因突变,会激活下游的AKT信号通路,减少细胞对生长因子的依赖,促进肿瘤细胞的侵袭。PIK3CA基因主要编码磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶的催化亚基p110,该基因主要调节细胞的增殖和分化,多数情况下处于非激活状态,一旦发生突变PIK3CA被异常激活,相关蛋白过度表达,从而促使细胞发生癌变,如形成乳腺癌、结肠直肠癌、脑癌或子宫内膜癌。乳腺癌是一种女性最常见的恶性肿瘤,严重威胁着全球女性的身心健康。在乳腺中PIK3CA基因的突变极为常见,比例约35%,相关的突变位点分别是H1047R、E545K和E542K,它们都是由单核苷酸变化引起的。对PIK3CA点突变的特异性检测对癌症早期筛查,预测抗癌治疗反应,以及癌症监测具有重要意义。
该文章于2022年9月发表在Talanta Open杂志,作者来自于维也纳大学物理与化学学院的Peter Lieberzeit教授团队。作者构建了不同突变位点的寡核苷酸序列作为捕获探针与红色荧光标记的目的片段进行杂交,其中H1047R构建了9种突变探针(分别是5-10号位,基因序列中心位,3'端以及5'端),E545K设计了1种(5号位突变),E542K(5号位突变)1种以及1组对照寡核苷酸序列。捕获探针固定于载体后与突变的目的基因序列进行杂交,只有在突变位点两个碱基可以相互配对才能产生强烈的荧光信号以及电信号。作者主要采用两种方式进行检测分析,一种方法使用英国ArrayJet生物芯片点样仪来制备高通量的探针芯片进行筛选,一种采用电化学的方式进行电信号分析,具体流程见图1。
图1突变位点检测: I.)微阵列分析A.采用镀金芯片作为载体通过共价结合来固定捕获探针,使用英国ArrayJet生物芯片点样仪在20℃温度和50%-60%湿度下进行野生型、突变型以及对照探针点印,样品浓度50uM,每张玻片被分为8个相同的微阵列,每个样本重复点印三次,然后用含有0.01% Tween 20的SSPE溶液和超纯水进行清洗,干燥后保存在-20℃备用 B.使用Cy-3和Cy-5标记的目的探针进行杂交,通过荧光信号强度的差异进行突变序列的位点分析 II.)电化学分析A.检测传感器图片,每个检测器包含12个金属电极,1个参比电极和1个平衡电极 B.自制的检测装置图片,该装置包括一个集成的加热系统以及一个磁性的传感器支架和连接器 C.使用生物素标记的目的探针进行杂交,同时加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、四甲基联苯胺TMB以及过氧化氢,TMB在过氧化氢的作用下会产生明显的电化学还原电流信号,通过电流差异分析突变位点情况。
在采用不同长度的突变体和野生型靶DNA寡核苷酸(24-mer和80-mer)检测时发现完美杂交的归一化荧光强度均高于错配杂交,因此两者都可以区分突变型和野生型目的DNA。然而,80-mer的目的DNA荧光强度低于24-mer,这可能由于长片段的目的DNA在5'端产生了空间位阻进而降低了两者的杂交效率,具体结果见图2。
图2检测点突变PIK3CA H1047R不同长度的目的DNA寡核苷酸: (A)微阵列分析:荧光强度在波长635纳米(Cy5标记的突变目标DNA)和532纳米(Cy3标记的野生型目标DNA)归一化的信号与最大荧光强度的比值 (B)电化学分析:每个捕获探针与目的片段杂交的还原电流值。
总结:通过微阵列实验和酶扩增电化学方法成功检测了3个与乳腺癌相关的PIK3CA点突变(PIK3CA H1047R、PIK3CA E545K和PIK3CA E542K),证明了该方法的高特异性,同时本研究的结果为进一步开发具有高灵敏度和高选择性的疾病检测手段奠定了基础。
原文链接:https://doi.org/10.1016/j.talo.2022.100150
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