冠状病毒是有包膜的单链RNA病毒,其刺突蛋白(S蛋白)可与动物身体上的受体细胞结合,继而入侵到动物体内。猪肠道冠状病毒(PECs)是商业猪群中高发的一类冠状病毒,主要包括:流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性肠胃炎病毒(TGEV)和猪三角冠状病毒(PDCoV)。目前PECs主要通过RT-PCR、免疫组化和病毒中和检测等方法进行鉴别和诊断。尽管PECs在致病性上存在差异,但它们在临床和组织病理学上都难以区分,因此利用其遗传特性开发新的快速检测手段至关重要。在单个反应体系中同时检测多个标记物,对于快速识别和分类相关病原体是一种尝试手段。S蛋白氨基末端S1亚基的受体结合域是血清学诊断的高敏感性和特异性抗原靶点,本研究则描述了一种基于病毒特异性重组S1蛋白的ELISA样多重平面免疫分析方法,蛋白点印在微孔板底部,同时检测血清样本中的PEDV、TGEV和PDCoV。工作原理与ELISA相似,样本结合强度与阵列中特定病毒抗原靶标的抗体水平相关。
该文章发表在Journal of Immunological Methods杂志,作者来自于美国爱荷华州立大学兽医学院。ELISA对多个病原体的抗体水平检测涉及到多个工作流程,不仅耗时而且也增加了成本和错误风险。使用多重平面免疫分析法,可同时对三种主要的PECs(PEDV、TGEV和PDCoV)进行血清学诊断。微阵列中样本矩阵的独特设计,同比色法相比,不仅减少了试剂消耗也降低了检测成本,而且更快速、更高灵敏度。具体方法:S1蛋白的结构域编码区在质粒载体和HEK293细胞中表达,进行纯化后,分别使用SDS-PAGE和Western blot进行表达结果验证,实验中480份血清样本批次接种PEDV、TGEV(Purdue和Miller亚型)和PDCoV的第(-7、0、7、14、21、28、35和42)天,在微孔板中进行孵育,随后加入特异性识别IgG的酶标抗体,以及底物四甲基联苯胺(TMB)进行显色,并使用德国Sensovation的多因子检测芯片扫描仪进行数据读取和分析,实验设计流程见图1。
图1:A.首先使用葡聚糖对康宁96孔板进行功能化包被,然后对纯化的重组S1蛋白(TGEV,PEDV,PDCoV)和IgG(阳性对照)抗体在板底进行三个重复的点印 B.血清样本在特定的缓冲液中以1:100稀释,100μL/孔加入微孔板,37°C下以300 rpm孵育1小时;用含有0.1%吐温20的PBS洗涤三次(200μL/孔);每孔中加入100 μL偶联缓冲液,在37°C的避光环境中孵育1小时;洗涤后,每孔加入50 μL不溶性的TMB底物,避光孵育15 min;每孔200μL超纯水洗涤;最后使用Sensovation扫描仪进行单个孔的图像扫描成像。
结果显示:PEDV S1的诊断敏感性为92%(44/48阳性),TGEV S1为100%(95/95阳性),PDCoV S1为98%(47/48阳性),见图2。
图2:A.不同时间截点血清样本IgG反应的检测结果(平均值和标准误差)B.病毒特异性S1抗原(PEDV S1、TGEV S1和PDCoV S1)的血清样本结果分布。
结果表明,AgroDiag PEC多重免疫分析法是一种有效、可靠检测PECs的血清学诊断方法。
Sensovation 成立于2000年。总部位于德国,一直致力于研发和生产科学级成像设备。Sensovation多因子检测芯片扫描仪可对兼容96孔板和各种生物芯片,也可与自动进样装置和液体处理工作站进行整合。在基因组和蛋白组表达,基因突变,病毒微生物检测,肿瘤特异性标志物筛查,自身免疫抗体分析等领域都有非常广泛的应用。
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