单细胞测序技术首次问世于2009年,十几年来不断完善和发展,尤其在近几年出现爆发式突破和应用普及。不同于传统的多细胞层面,单细胞测序技术聚焦于单个细胞,是对单个细胞在基因组、转录组、表观基因组及蛋白组等水平进行测序分析的技术,反映了细胞间的异质性。此外,单细胞平台一次性可以分离、分析几千个单细胞,有助于分类或定义新的细胞类型。单细胞测序技术的发展和更新,为研究解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供了方向,为早期检测、诊断疾病及疾病个体化治疗提供指导。
与传统测序相比,单细胞测序技术更为困难和复杂,存在样本量小、RNA降解快、噪声和批次效应等问题,需要特殊的实验设计、数据处理和分析方法,每次实验都会耗费大量的时间、费用以及无形的机会成本。因此单细胞测序平台都非常强调样品制备的重要性,包括精确测量细胞浓度、活率以及确定样本组成等,这些参数决定了下游实验的成败。
Moxi GO II快速流式细胞仪
美国Orflo Technologies公司将行业公认的细胞计数金标准——库尔特原理(Coulter Principle),与荧光流式检测技术相结合,推出的新一代快速流式细胞仪——Moxi GO II,提供超准确的细胞计数、细胞活率检测,以及超高分辨率的细胞粒径测量,可用于评估样本纯度、准确的细胞核计数和细胞表型分析,非常适用于单细胞测序中细胞样本制备的质控。
图1. Mxoi GO II
何为库尔特原理?
细胞/颗粒和缓冲液导电性不同,在恒定电流设计的电路中,悬浮在缓冲液中的颗粒/细胞随缓冲液通过小孔管时,取代相同体积的缓冲液,从而导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化,产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。
图2. 库尔特原理视频,请点击图片链接
库尔特原理对颗粒个体进行逐个三维测量,不但能准确测量颗粒的粒径分布,更能进行粒子绝对数目和浓度的测量。由于检测时不受激光衍射、散射因样本颜色或浓度变化的影响,库尔特原理所测粒径大小更接近真实。
Moxi Go II的性能
卓越的细胞计数和活率检测能力
采用库尔特原理的Moxi GO II系统可对样本中的细胞进行逐个计数和体积测量,几秒钟内计数多达40000个细胞,数据统计的准确性和可靠性远高于成像类细胞计数仪(每次只检测几百个细胞)。此外,Moxi GO II还配备了488nm激光激发光源及两个PMT荧光检测通道,能够进行基于碘化丙啶(PI)荧光染料的细胞活率检测,其检测灵敏度、准确度与流式细胞仪相当,远高于成像类细胞计数仪(如图3所示)。Moxi GO II细胞计数和活率测量结果的准确性和一致性,为单细胞测序中细胞样本的质控提供了可靠依据。
图3. 不同检测系统的计数和活率检测CV值
无与伦比的粒径分辨率
成像类细胞计数仪基于2D图像分析,通过软件算法识别细胞边界以确定细胞直径,这种方法依赖成像效果,不确定因素多,易出现“误判”,如将碎片识别为细胞等。Moxi GO II根据库尔特原理,采用的是3D立体测量,获得更为真实的细胞大小信息,提供高分辨率的细胞粒径分布图。如图4所示,将5种不同大小的微珠(4.1μm,6μm,7.9μm,10.1μm,和 16μm)混样,分别用Moxi GO II和成像类细胞计数仪检测,结果发现,Moxi GO II能够很好的区分5个峰,而成像类设备只能区分两个峰,前面的4个峰无法区分开来(图4红框内)。
图4. Moxi GO II提供高分辨率直方图 | 图5. 健康和不健康样本结果叠加比较 |
提高粒径分辨率能为研究者提供细胞状态的评判参考,保证单细胞测序实验顺利进行。如图5所示,研究者用Moxi GO II内置的结果叠加比较功能,将“健康”Jurkat细胞(绿色曲线)与缺氧、室温环境下处理的“不健康”Jurkat细胞(灰色曲线),进行粒径分布比较,发现二者粒径分布差别较大。“不健康”细胞小颗粒(此实验中4-9μm)数量明显增加,总平均细胞粒径减少(图5 红框内),这些变化可能与细胞破碎有关。不健康的样品含有细胞破碎产生的游离DNA/RNA,会干扰和影响测序结果,所以根据该粒径信息可快速选择符合要求的细胞样品。
图6. 聚集和非聚集样本结果叠加比较
高分辨率的直方图结果,也可用于评估细胞样本的聚集程度,研究者可据此评估是否需要在后续操作之前对样本进行调整。单细胞测序技术要求样本为单细胞悬液,以确保每个油滴中仅捕获一个细胞。细胞聚集状态会对下游实验造成重要影响。如图6所示,在Moxi GO II系统中,将聚集的HEK-293细胞结果直方图(灰色曲线)与单分散的单细胞样本结果直方图(绿色曲线)叠加比较,发现灰色曲线不仅峰值分布的偏斜(长尾)的显著增加,而且还显示了模态峰值的增加,因为样本主要由多峰(细胞簇)组成。
样品纯度评估指标
在单细胞测序技术样本制备过程中,关键部分是将单个细胞包裹进油包水的微液滴中。
图7. PBMC纯度,RBC污染 | 图8. 磁珠纯化 |
因此,当研究人员研究特定类型细胞时,尽可能最大限度提高含有该类型细胞的液滴比例。Moxi GO II可通过粒径和荧光测量来评估样品纯度,如图7所示。图中红色直方图是粒径分布图叠加。研究者可通过粒径门控计算RBC“污染”程度(黄色箭头所指为RBC峰),还可通过荧光标记,进行第二维度的纯度检测(黄色框内是通过PE-CD45(HI30)抗体标记的白细胞)。
单细胞测序技术常用磁珠来纯化细胞。图8展示了初始PBMC样本(灰色曲线)与磁珠分离后的单核细胞(绿色曲线)粒径直方图比较,分离后,去掉了较小的淋巴细胞峰。Moxi GO II高分辨率粒径测量为研究者带了便利,可通过无标记的粒径分布来验证样品纯度。
精确的细胞核计数
单细胞测序技术中,当样本为细胞核,需要对其进行精确计数和测量。由于细胞核体积较小(直径通常为4-9μm),成像类细胞计数仪难以提供可靠的结果。而Moxi GO II可分辨低至3μm的颗粒,对细胞核进行快速可靠的计数。同时,还可通过PI染色,增加细胞核分辨率。如图9所示,图9a为完整PBMC细胞检测结果(活率vs粒径散点图),图9b为裂解后细胞核检测结果,计数结果相同(1.23e5/ml)。分离的细胞核样本粒径减少,荧光信号增强,符合预期。
图9. 细胞核计数
细胞表型分析
单细胞测序中,使用细胞表面免疫标记进行表型分析,即用于基因组分析之前简单地确认或鉴定细胞组成(例如,PBMC样品中CD8阳性T细胞的百分比),也可以用于样品纯度检测(例如,在T细胞分选或磁珠分离后使用CD3来确定T细胞纯度)。Moxi GO II具有488nm激光器和两个PMT,可同时检测两个荧光团(例如FITC和PE),进行精确的计数和粒径测量。如图10所示,具有FITC抗人CD8(HIT8a,BioLegend)和PE抗人CD3(OKT3,BioLegend)的双重标记。使用Moxi GO II象限门控可轻松圈定阳性与阴性群体的荧光,使研究人员能够区分细胞群体。对于分选后的纯度检测,第一PMT/通道(525/45nm)可用于纯化细胞的独特抗体标记。第二通道646nm/LP可用于测量PI染色(活率)。通过这种设置,研究者一次测试,可获得了多个质控信息:表型纯度、尺寸分布(例如聚类)、浓度和活力。
图10. 细胞表型分析
总结:
单细胞测序技术独特复杂,成本昂贵,因此样本处理制备就显得尤为重要,是下游实验成败的基础。Orflo的Moxi GO II系统非常适用于细胞样本的全程监测。 Moxi GO II采用库尔特原理进行细胞计数和粒径测量,同时采用488nm激光光源,结合两个PMT通道,525/45nm通道和561nm/LP(或者646nm/LP,可根据需要更换),进行细胞活率、细胞凋亡、转染效率、活性氧簇、线粒体膜电位等常规流式检测。
仪器设计小巧轻便,无需预热,开机即用,预设程序,触屏操控,运行后10秒即可给出测试结果,使用后也无需清洁维护。Moxi GO II功能多样,简单易用,为广大研究者提供了一个非常实用的检测工具。通过Moxi GO II,无论是经验丰富的流式专家,还是初试身手的实验小白,都可以轻松完成实验。
美国Orflo Technologies公司是一家非常专业的细胞分析仪器研发和制造企业,拥有多项专利技术,产品以库尔特原理的高精细胞计数仪和超快流式细胞仪为主。作为中国地区独家代理,环亚生物科技有限公司全权负责Orflo Technologies产品在中国地区的推广、销售,为广大用户提供专业的技术咨询和产品服务。
环亚生物,生命科学产品全国性代理商,不断把国外顶级的创新产品引入中国。环亚生物具备完善的公司运营、产品管理、营销、售前技术支持和售后维修体系。
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