背景知识:
细胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)是由细胞释放到胞外的脂质双分子层包裹的微小囊泡。近年来,研究者对血液样本中EV分析越来越感兴趣,主要源于细胞分泌的EV携带多种物质如核酸,蛋白质,脂质等,可以作为生物标志物表征病理生理过程。由于血液成分的复杂性阻碍了EV的准确检测,从而减缓了其在临床应用中的发展。目前已有多个研究证明,不同EV回收方法得到的不同回收效率和纯度的EV,会影响血液样本中基于EV的生物标志物分析。虽然研究人员在尝试理清整个EV检测流程中,包括血液采集管(BCT)的类型以及血液处理间隔(BPI)(即血液采集和处理之间的时间)等因素,但真实情况仍未明确。另外,没有适当且可量化的指标用于帮助选择最适合研究目标的BCT和BPI。因此,建立和验证BCT和BPI的标准操作程序(SOP)至关重要,这也是建立可靠临床相关的生物库的先决条件,以及EV相关生物标志物发现和验证的前提条件。
2023年3月,比利时根特大学Bert Dhondt等在《Journal Of Extracellular Vesicles》杂志上发表了题为:Benchmarking blood collection tubes and processing intervals for extracellular vesicle performance metrics的研究论文。作者详细评估了11种BCT对9项性能指标的影响,包括血样质量、EV稳定性、EV血细胞来源和EV相关蛋白质组和小RNA转录组特征等,并对三个临床相关样本的BPI进行了额外评估(如图1)。
图1. EV血液标准(EVBB)研究实验设计
实验方法:
从健康人和癌症患者处获取血液样本,经血液指标分析与溶血分析后,合格血液样本进入后续实验。通过已有的分离方案,结合体积排除色谱(size-exclusion chromatography, SEC)和Optiprep密度梯度超速离心(ODG),从血清和血小板贫化血浆(Platelet depleted plasma, PDP)样品中分离EV。继而对分离获得的EV进行物理表征,涉及尺寸和形态,同时液相色谱-串联质谱法和二代测序等对EV进行蛋白组和转录组信息表征。其中 small RNA的文库制备,由sage science公司的 Pippin系列全自动DNA片段回收仪结合3% agarose预制胶,精准回收125-153 bp范围的small RNA,去除杂带,使得测序结果聚焦目标small RNA,清晰展现EV的small RNA图谱。
在本文中,作者进行了第一次大规模EV血液标准(EV Blood Benchmarking , EVBB)研究,全面比较了BCT(n=11)和BPI(n=3)对EV分析的影响,目的是建立优化血液EV分析程序,开发并实施反映样本质量、EV回收率、血细胞衍生EV亚型的离体释放以及EV相关分子特征的性能指标。基于这些发现,本文为研究人员提供了一般性建议,即根据情况选择相应的BCT和BPI(图2)。综上说述EVBB研究有助于血液EV研究方法的标准化提供性能指标,作为新开发的BCT、额外BPI以及其他因素分析的框架,并支持EV研究方法的进一步标准化。
图2. 选择BCT和BPI进行血液EV分析的一般考虑因素
引用文献:
Dhondt, Bert, et al. "Benchmarking blood collection tubes and processing intervals for extracellular vesicle performance metrics." Journal of Extracellular Vesicles 12.5 (2023): e12315.
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