蜱传脑炎,是一种由蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)引起的,经蜱虫传播的传染病,呈现各种神经系统病症,目前尚无特效疗法。其诊断主要依赖于TBEV抗体检测,如酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent ascept, ELISA)和免疫荧光试验(immunofluorescence assay, IFA)。然而,蜱传脑炎病毒所属的正黄病毒属内有很多病毒都存在高度交叉反应,导致TBEV抗体检测的结果有偏差,例如检测中出现西尼罗河病毒( West Nile virus ,WNV)的假阳性结果。因此急需找到一种高灵敏性和强特异性检测TBEV的方法。
来自荷兰国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心的团队,于2024年2月在《Viruses 》上发表了这篇文章。该研究利用蛋白微阵列芯片技术,改进了检测TBEV的方法。
TBEV病毒所属的正黄病毒属,其序列相对保守,是一个含有约11000个碱基的正链RNA病毒,有3个结构蛋白:C,prM和E蛋白,以及7种非结构蛋白:NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。E蛋白包含EDI、EDII和EDIII三个结构域(图1 )。作者在之前的研究中,使用重组NS1(rNS1)蛋白检测基于NS1多重蛋白微阵列中的抗正黄病毒IgG。通过多重微阵列方法,使用少量样本体积(例如 10 μL 血清)就能快速、高通量同时检测针对多种病毒蛋白的抗体。本文,作者进一步优化,在NS1抗原旁边添加了EDIII抗原,提高了检测TBEV IgG的灵敏度和特异性。
图1 正黄病毒属基因组与实验中构建的EDIII/rNS1基因载体示意图
实验方法
1.制备蛋白微阵列芯片
将TBEV、WNV、ZIKV(寨卡病毒)、USUV(乌苏图病毒)、JEV(日本脑炎病毒)、EDNV(登革热病毒)的EDIII和NS1蛋白,利用英国Arrayjet公司的Marathon系列生物芯片点样仪(新型号Mercury系列)制备成蛋白微阵列芯片。
2.血清样本与蛋白微阵列芯片杂交孵育
感染过或疑似感染过DENV、ZIKV、WNV、USUV、TBEV的患者血清,阴性血清分别与蛋白微阵列芯片杂交孵育,并用芯片扫描仪获取杂交结果。
3.蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test ,PRNT)
将上述血清与病毒混合后孵育,然后加入预先形成的A549单层细胞中,观察并计数斑块形成情况。同时与蛋白微阵列芯片杂交结果比较。
实验结果
NS1蛋白微阵列芯片结果呈现属内高度交叉反应
在NS1的蛋白微阵列芯片杂交结果中,所有的阴性血清都无免疫特异反应。来自感染过或疑似感染过上述病毒的患者血清杂交实验中,大部分血清都和相关抗原出现了免疫阳性结果,而且这些患者血清同时与属内其他病毒出现了阳性反应,这与此前报道的正黄病毒属内有很多病毒都存在高度交叉相一致。
免疫学检测金标准--PRNT的实验结果显示,NS1蛋白微阵列结果中出现的阳性结果在PRNT中都为阳性。在20例TBEV的患者血清实验中,除了蛋白微阵列芯片已经确认的7例之外,还有8份血清也呈现阳性。说明单独检测NS1抗原存在假阴性结果,因此基于NS1抗原的蛋白微阵列流程需要进一步优化。
TBEV EDIII的蛋白微阵列实验结果
为了提高蛋白微阵列检测的灵敏性和特异性,使用EDIII阳性血清(来自接种TBEV疫苗志愿者)和上述血清再次与EDIII蛋白微阵列芯片杂交。结果显示,之前的20份TBEV患者血清 EDIII杂交结果与PRNT结果完全一致——15份血清为阳性,5份为阴性。而这些血清样本对WNV、DENV、ZIKV、USUV 和 JEV 的IgG反应水平则比较低。这说明EDIII的确存在属内交叉反应,但TBEV的反应水平则远高于其他病毒。
实验结论
正黄病毒属内病毒在血清学检测中的确存在高度交叉性,PRNT实验验证了这一结论。通过在蛋白微阵列芯片中联合使用TBEV NS1和EDIII抗原蛋白,可以提高TBEV检测的灵敏性和特异性,有助于在感染早期快速发现TBEV感染,争取治疗的窗口期。
更多内容请阅读原文:https://doi.org/10.3390/v16020286
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