Western Blot内参简介

南京森贝伽生物科技有限公司

2014/11/14 11:34

Western Blot内参简介
一.众所周知，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的蛋白上样，才有比较的基础。特别是在表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以需要内参做对比。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，以保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。
二.实验中出现的问题及处理办法
1、为什么带出现拖尾现象？
原因：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的；
处理办法：加样前离心，选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制;降低凝胶浓度。
2、为什么带出现纹理现象？
原因：主要是样品不溶性颗粒引起的；
处理办法：加样前离心，加适量样品促溶剂。
3、为什么电泳的条带很粗？
原因：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因；
处理办法：适当增加浓缩胶的长度，保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7），适当降低电压。

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