取100ul全血,加入适量Anti-human CD4和Anti-human CD25,4 ℃孵育30 分钟(根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量)。按个人要求设置空白管、补偿管、同型对照管和样本管。
染色完的全血不用洗,每管加入2-3ml 1X RBC Lysis Buffer,混匀。室温孵育10分钟。
观察溶液透亮后,300 -400 g离心5分钟,去上清。
加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer,300 -400 g离心5分钟,去上清。
重复洗一次。
制备固定/破膜工作液:1份Fixation/Permeabilization Concentrate加入到3份Fixation/Permeabilization Diluent中,按样品量现用现配,每管用量为1ml。
旋涡震荡细胞沉淀,每管加入1ml的固定/破膜工作液(第6步配置准备的),并再次旋涡混匀。
避光4℃孵育30分钟到60分钟,在此时间内效果一致。
加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer,300 -400 g离心5分钟,去上清。
重复洗一次。
样本管中加入5ul或1test的Foxp3抗体,同型对照管中加入0.25ug Rat IgG2a K Isotype Control PE,保证最终染色体积不大于100ul,避光4℃孵育30-60分钟,根据结果优化染色时间。
加入2ml Flow Cytometry Staining Buffer洗涤细胞并弃去上清液。
用300-500ul Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。