2015最新ELISA试剂盒操作步骤及注意事项

上海盈公实业有限公司

2015/01/22 14:39

1、样品稀释
ELISA试剂盒反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。我公司产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如TORCH产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。
2、试剂盒平衡
试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20～30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒打开盒盖置37℃温箱20分钟。
3、样品和试剂的混匀
稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。
4、洗板
洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。

实验操作注意事项:

1、试剂价格较高，实验前有任何疑问及实验中有任何问题请及时与本公司取得联系，避免造成损失！

2、试剂盒应在2～8℃冰箱内储存，且注意不可冻结。

3、请勿使用过期的试剂盒或其中的组件或混用不同批次试剂盒的试剂，以免降低灵敏度。

4、0标准品的A450nm<0.6时，表示试剂可能变质，请勿使用；显色剂变蓝，表明已变质，请勿使用。

5、将试剂盒内试剂稀释或者改变其浓度将会影响检测结果。

6、当从冰箱中取出试剂盒进行检测时，应将试剂盒于室温(20～26℃)下放置半小时以上，使其温度回升至室温。

7、试剂盒内的各种试剂在使用前应充分摇匀(酶标物溶液轻摇即可，不可起泡)，以确保试剂浓度的均一性。

8、微孔条按需使用，将剩余的微孔条立即放入包装袋中，于2～8℃干燥密封的条件下保存。

9、向酶标板微孔中加入试剂或样品时，为确保操作的一致性，加液时枪头应垂直悬空至板孔正中央，保证样液应加至孔中央，动作迅速，避免枪头接触孔壁，避免样液溅到孔壁或溅出微孔，造成不必要的非特异性吸附或损失。特别是加入共同试剂(如酶标抗体)，由于可能会用到排枪，该操作尤为重要。

10、加样完毕后，应将酶标板至于振荡器或用移液器枪头轻敲，使孔中液体充分混匀，但需注意的是切勿不可将孔中的液体摇出，影响检测结果。

11、样品前处理注意事项：尿样，若样品中出现浑浊或沉淀，可将其至于离心机中适当离心，取其上清液作检测样品;肝样或肉样，请参照说明书提供的方法进行提取。于水浴锅中提取时，水浴应始终保持沸腾，若由于其他原因达不到所需温度(但不得低于85℃)，可适当延长提取时间，直至组织样品明显变色为止(由红色变黄褐色或白色)，且最好趁热进行离心，离心力保持在4000g/r以上以保证上清液澄清。

12、如果选择室温条件下反应，在整个检测过程中，应保持温度在20～26℃之间，同时为了避免反应过程外界环境因素的影响，酶标板上应贴上一层薄膜或置于封闭环境中避光反应；如果选择37℃条件下反应，建议在水浴锅中进行，且酶标板上也应贴上一层薄膜，防止试剂的挥发。

13、洗板时如果选择蒸馏水作为洗液，要保证洗涤用水的pH范围在6～8之间；如果水质较差请选择试剂盒配备的浓缩洗液稀释后作为洗液。为了确保洗涤的一致性，建议洗涤时采用专门配置的洗板机，反复洗涤6次，每次洗涤的体积以溢满微孔为宜(约300μL)。如用其他方法洗板时，请注意操作方法，避免清洗不彻底或产生交叉污染。

14、在加入酶底物液进行显色时，可向板孔中先加50μL的底物缓冲液，然后再加入50μL的底物液(注意加完后混匀液体)，或者将底物缓冲液和底物液充分混匀后(混匀容器应洁净，现配现用)，再向每孔中加入100μL的混合液。

15、终止液含有1mol/L硫酸溶液，避免皮肤直接接触，操作时要注意安全。

16、推荐使用高质量的吸头及移液器，且吸头不可反复使用(难以清洗干净)。

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