兔抗磷脂抗体（APA）ELISA检测试剂盒操作步骤

2016-01-26 09:09 下载量：1

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兔抗磷脂抗体（APA）ELISA检测试剂盒操作步骤兔抗磷脂抗体（APA）ELISA检测试剂盒试验原理： APA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知APA浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将APA和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中APA的浓度呈比例关系。操作注意事项 1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。 2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。 3．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。 5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。 8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。样品收集、处理及保存方法 1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2、血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。 3、细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4、组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液 5、保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。兔 (Rabbit)抗磷脂抗体(APA)ELISA检测试剂盒操作步骤 1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。 2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。 3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。 4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 5．每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。 6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。 8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。 9．在450nm波长处测定各孔的OD值。局限 6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。试剂盒性能 1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。 2. 特异性：不与其它细胞因子反应。 3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。结果判断与分析 1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值 2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的APA标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的APA含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。 3、检测值范围：0-80IU/L 4、敏感度： 0.1 IU/L

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文献贡献者

上海纪宁生物科研有限公司

银牌会员 | 第3年

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