人脂多糖结合蛋白检测ELISA试剂盒技术标准品

2016-04-05 09:50 下载量：1

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人脂多糖结合蛋白ELISA检测试剂盒检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被脂多糖结合蛋白（LBP）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂多糖结合蛋白（LBP）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。样品收集、处理及保存方法 1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。 3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。 4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。 5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于 -20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品 1. 酶标仪（450nm） 2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒温箱人脂多糖结合蛋白ELISA检测试剂盒操作注意事项 1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20 分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。 2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。 3. 浓度为0 的S0 号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5 倍，最终结果乘以5 才是样本实际浓度。 4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。 5. 所有液体组分使用前充分摇匀。试剂盒组成名称 96孔配置 48孔配置备注微孔酶标板12 孔×8 条12 孔×4 条无标准品0.3mL*6 管0.3mL*6 管无样本稀释液6mL 3mL 无检测抗体-HRP 10mL 5mL 无 20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释底物A 6mL 3mL 无底物B 6mL 3mL 无终止液6mL 3mL 无封板膜2 张2 张无说明书1 份1 份无自封袋1 个1 个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、15、30、60、120、240μmol/L 试剂的准备 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20 稀释，即1 份的20×洗涤缓冲液加19 份的蒸馏水。洗板方法 1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min 后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5 次。 2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。操作步骤 1. 从室温平衡20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。 2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL； 3. 样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。 4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。 5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5 次（也可用洗板机洗板）。 6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。7. 每孔加入终止液50μL，15min 内，在450nm 波长处测定各孔的 OD 值。人脂多糖结合蛋白ELISA检测试剂盒结果判断绘制标准曲线：在Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应 OD 值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。试剂盒性能 1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R 值，大于等于 0.9900。 2. 灵敏度：最低检测浓度小于1.0μmol/L。 3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。 4. 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。 5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。 6. 有效期：6 个月免责声明 1. 试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。 2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。

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文献贡献者

上海纪宁生物科研有限公司

银牌会员 | 第3年

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