温育是小鼠ELISA试剂盒测定最为关键、最容易出现问题的步骤。最为常见的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。目前国内售ELISA 试剂盒温育时间为37℃，30 min~1 进口ELISA试剂盒则通常为37℃，1～2 h 能有较完全的结合。
温育时间、温度的选择一般根据试剂盒的说明书选择温育的时间、温度。加完样本和（或）试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃需要一定时间，如果是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就容易造成实际测定中温育时间不够，易致弱阳性标本测不出来。控制方法：
①如有两种温度，尽量使用较低的温育温度、较长反应时间的条件
②用1个小温度计放置在板孔反应液中测量观察。
孵育前加样时间过长，酶试剂加出孔外，使用滴瓶滴加试剂时，滴加的角度不同和挤压的力度不同，致使滴加的试剂量不准，都可导致试验结果不准确。小鼠ELISA试剂盒控制方法：
①实验样本过多时，可分批次操作，以减少实验时间延长造成的误差；
②加酶试剂后，用吸水纸吸干孔外试剂；
③作定量试验时，使用加样器加注试剂，并经常校正其准确性，此外，要做到一份样本一个移液头，防止交叉污染。
使用96 孔板的ELISA测定中，外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是为96 孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的，因此在温育时尽量采用水浴。
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